醋酸纤维素薄膜电泳简介

    醋酸纤维薄膜电泳(cellulose acetate membrance electrophoresis)以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔薄膜,厚度以0.1 mm~0.15 mm 为宜。太厚吸水性差,分离效果不好;太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。

 

应用

醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋 白,甲胎蛋白,类固醇激素及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低,但它具有简单,快速等优点。

 

特点

1.  醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后背景能完全脱色,各种蛋白质染色带分离清晰,因而提高了测定的精确性。

2.  快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小,薄膜中所容纳的缓冲液也较少,电渗作用小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以分离速度快,电泳时间短,一般电泳45~60 min 即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需90 min 左右。

3.  灵敏度高,样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清,甚至加样体积少至0.1 μl,仅含5 μg 蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点,检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。

4.  应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离,如胎儿甲种球蛋白,溶菌酶,胰岛素,组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。

5.  醋酸纤维薄膜电泳染色后,经冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于扫描定量及长期保存。

6.  醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,操作简单,但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中,只能分离出5~6条区带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。

 

注意事项

1.  醋酸纤维薄膜的预处理

市售醋酸纤维薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮15 s~30 s 时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡30 min 以上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子。


2.  缓冲液的选择

 

醋酸纤维薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液,其浓度为0.05 mol/L~0.09 mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm~10 cm,则需电压25 V/cm膜长,电流强度为0.4 mA/cm~0.5 mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨。


3.  加样量

加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利。如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1 μl~0.5 μl约相当于5 μg~1000 μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时,每厘米加样线加样量不超过1 μl,相当于60μg~80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。


4.  电量的选择

电泳过程应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.4 mA/cm~0.5 mA/cm宽膜为宜。电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸。电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散。


5.  染色液的选择

对醋酸纤维薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色;应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色时间。时间长,薄膜底色深不易脱去;时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染。


6.  透明及保存

透明液应临用前配制,以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前,薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好,如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解,太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中,使薄膜软化。如有水,则液体石蜡不易浸入,薄膜不易平展。



             此文转载:丁香通

 

 

 


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