免疫组织化学前处理注意事项
1. 冰冻切片

冰冻切片应在-70°C 环境下保存。在做实验前将冰冻切片取出,室温下复温。PBS 洗 3 次,每次 5 min。未固定的切片需使用丙酮 4°C 固定 10 min。已使用 4% 多聚甲醛固定的冰冻切片,若待检抗原位于细胞内,需使用 0.2%Triton-100 进行通透,PBS 洗 3 次,每次 5 min。丙酮固定的切片一般不需要通透。随后根据采用的检测方法进行相应内源性活性物质的灭活等实验步骤。冰冻切片一般不需要抗原修复。

2. 石蜡切片烤片

目前组织学实验一般都采用经过处理的防脱载玻片,石蜡切片展片后放入 60°C 烤箱中烘烤 4~8 h 以内或在 70°C 烤箱中烘烤 1 h,对于抗原性较弱的组织切片可以在 37°C 烤箱内烘烤过夜以固定切片。

3. 内源性干扰因素的消除

抑制内源性过氧化物酶活性:肝组织、肾组织、肌肉组织以及红细胞粒细胞系统存在较多的内源性过氧化物酶,内源性过氧化物酶会与 HRP 底物/显色剂反应引起非特异性显色,因此,在采用 HRP 法进行免疫组织化学染色时,需抑制内源性过氧化物酶的活性。通常使用 3% 过氧化氢甲醇溶液或过氧化氢水溶液处理 5~10 min,或是 0.3% 过氧化氢甲醇溶液或过氧化氢水溶液处理 20 min,至组织不见明显气泡为止。过氧化氢甲醇溶液更适合于血涂片或其它富含过氧化物酶的组织(如肝脏)。过氧化氢甲醇溶液可减少在水溶液中反应时对组织的损坏,但是孵育后会降低一些抗原抗体的结合,特别是细胞表面蛋白。对于其它组织,应使用过氧化氢水溶液。在大多数经过 10% 中性福尔马林固定的组织中,内源性过氧化物酶对免疫组织化学染色特异性信号影响较小,但是在冰冻切片和细胞涂片中过氧化物酶活性较强,因此进行 HRP 法免疫组化实验时,需抑制内源性过氧化物酶。

内源性生物素的消除:应用 SABC 法、LsAB(SP)法进行实验时,需消除内源性生物素引起的非特异染色,可采用 30% 蛋清水溶液、0.01% 亲和素溶液或商品化专用封闭试剂处理 15 min 来封闭内源性生物素。

内源性碱性磷酸酶的消除:内源性碱性磷酸酶可与碱性磷酸酶底物/显色剂反应,产生非特异显色反应。因此在应用 AP 法进行免疫组织化学实验时,需在显色液内添加终浓度为 2~4 mmol/L 的左旋咪唑抑制大部分内源性碱性磷酸酶。

封闭内源性非特异性抗体结合物质:使用二抗同种动物来源的正常血清预处理组织可减少第二抗体与组织内的内源性免疫球蛋白发生交叉反应而引起的非特异性结合反应。组织中带有高电荷的胶原和结缔组织成分可吸附蛋白,在加一抗前用正常血清孵育可避免组织上带电荷基团与第一抗体的非特异性结合。正常血清孵育也可消除 Fc 受体与一抗和二抗的结合。抗体稀释缓冲液中的 BSA 能降低疏水作用引起的非特异结合。在使用免疫荧光 (IF) 法进行检测时,经醛类如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定的组织样品,其所含游离醛基会与一抗和二抗结合造成高背景染色。甘氨酸能结合自由醛基,因此在加一抗前用含 0.3M 甘氨酸的封闭液可以消除自由醛基的干扰。

4. 石蜡切片抗原修复

由于病理组织学常规使用的甲醛固定剂可以造成蛋白质的交联,即在氨基酸分子间形成亚甲基桥从而造成部分或大部分抗原结合位点(抗原决定簇)的封闭。通过抗原酶修复和抗原热修复方法可以有效地使抗原结合位点重新暴露。

(1)抗原酶修复

常用的消化酶种类:胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K、无花果蛋白酶、链霉蛋白酶等。
‚酶消化条件:0.05% 胰酶,37°C 消化 10~40 min;
        0.4% 胃蛋白酶消化 30 min~6 h;
        蛋白酶 K(20 μg/ml)消化 15~30 min

ƒ适用哪些抗体
在选择用何种酶消化时,应针对要显示的抗原成分来选用不同的酶。一般胃蛋白酶和菠萝蛋白酶消化主要用于细胞间质抗原的检测,例如纤连蛋白(fibronectin)、层连粘蛋白(laminin,LN)和各种胶原的显示;其它酶消化均可用于细胞内抗原的检测。

注意事项
配制蛋白酶时,应考虑酶的最佳 pH 和活性辅助因子。例如,胰蛋白酶的最佳 pH 为 7.6,要在钙离子的激活下于 37°C 才能达到最佳效率;而胃蛋白酶则在酸性 pH 值下才能达到最佳效率。蛋白酶 K 的消化作用通常需要加入 EDTA 以稳定酶的结构。经酶消化后的切片应充分洗涤,以去除残留的消化酶,否则会对抗体或组织进行缓慢消化,影响抗原抗体的结合,破坏组织机构。

(2)抗原热修复

抗原热修复方法:水浴法、微波法、高压法

‚热修复条件:

A 水浴法
将脱蜡至蒸馏水的切片置于 95~99°C 的抗原修复液中加热处理 15~20 min,随后冷却至室温;

B 微波法
将脱蜡至蒸馏水的切片置于沸腾的抗原修复液中微波中火持续 10~15 min,冷却至室温;

C 高压修复
在高压锅内加入一定量的缓冲液,加温至煮沸,将脱蜡至蒸馏水的切片置于沸腾的抗原修复液中,盖上锅盖,当高压锅气阀喷气后计时 3 min,冷却至室温;

D 酶修复和热修复方法结合
ƒ常用热抗原修复液种类
0.01M 柠檬酸钠溶液(pH6.0)、1 mM EDTA 溶液(pH8.0)、10 mM Tris-1 mM EDTA-0.05%Tween-20(pH9.0)、0.05% 柠康酸酐(pH7.4)。

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