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实验专栏丨精细实验步骤get,肿瘤细胞软克隆实验!

软琼脂克隆形成试验是一种广泛应用于体外细胞转化的技术。
     历史上,帕克等人在1956年提出的克隆实验用于评估细胞形成克隆的能力,在这种技术中,细胞被分散到培养板上,生长在饲养细胞或含有必要生长因子的条件培养基上。
这种技术的局限性在于它只提供了关于克隆形成的信息。正常细胞脱离原来生存环境发生一种特定类型的程序化死亡形式,称为失巢凋亡。
然而,转化细胞具有在不与底物结合的情况下生长和分裂的能力。为了利用这一概念,研究人员开发了软琼脂克隆形成试验。近年来,软琼脂克隆形成试验已被改进,以满足特定的需要,一种是掺入荧光染料,允许高通量菌落计数,另一种是使用专门的琼脂溶液,以便在需要蛋白质或DNA样本进行克隆形成后检索活细胞。
          
                       图 肿瘤细胞软克隆实验结果
     在传统的软琼脂克隆形成试验中,细胞生长在上层含有细胞培养基的软琼脂中,下层软琼脂也与细胞培养基混合,但含有较高浓度的琼脂。这可以防止细胞贴附在培养板上,还可以使转化细胞形成可见的菌落。这种技术的原理是正常细胞依靠细胞与细胞外基质的接触才能生长和分裂,相反,不管周围环境如何,转化细胞均具有生长和分化的能力,因此能够以锚定独立的方式形成菌落的细胞被认为是转化和致癌的。这种方法的总体目标是以半定量和严格的方式测定细胞的这种能力。

     实验操作:
     准备材料和试剂:
     1、配制2×培养基:1 g培养基粉末,0.2 g碳酸氢钠,加入去离子水,定容到50 mL。
     2、将培养基经0.2 μm滤膜过滤除菌。
     3、加入目标细胞所需培养基的其他成分。例如:用RPMI 1640培养基培养CMT 167细胞需要加入10% FBS,1% 青霉素/链霉素。使用之前将培养基放在37°C水浴。
     4、配制1×培养基,依照目标细胞生长所需培养基配制。
     5、配制1%琼脂:1 g琼脂加入到100 mL去离子水中。
     6、配制0.6%琼脂:0.6 g琼脂加入到100 mL去离子水中。
     7、将配好的琼脂经高温高压灭菌,灭菌后可放在4°C保存,使用前加热至完全溶解。
     8、配制氯化硝基四氮唑蓝溶液:1 mg/mL氯化硝基四氮唑蓝加入到1×PBS中。

     铺下胶:
     1、将熔化的1%琼脂溶液和预热的2×培养基放入装满热水(42°C)的桶(或水浴锅)中,在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。
     2、6孔板中的每个孔需要加入1.5 mL混合的琼脂和培养基,为保证足够的量,一个6孔板准备12 mL。
     3、首先加入6 mL的培养液到50 mL的锥形管,再加入6 mL的1%琼脂溶液。将锥形管多次翻转混匀,每个孔中迅速加入1.5 mL混合液,加混合液时不能产生气泡。
     4、室温静置30 min,待下胶凝固。

     铺上胶:
     1、收获的细胞用胰蛋白酶消化,用培养基以1:5的比例稀释(如1 mL胰蛋白酶,加4 mL培养基),放入15 mL锥形管。
     2、细胞计数:以每孔5000个细胞作为起始,并根据需要进行调整。
     3、细胞悬浮液的体积需要1.5 mL。一个6孔板准备12 mL细胞悬液。
     4、将熔化的0.6%琼脂溶液放入装有热水(42°C)的桶中,在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。
     5、以1:1的比例混合0.6%琼脂溶液和细胞悬液,吸取6 mL细胞悬浮液到50 mL锥形管,再加入6 mL的0.6%琼脂溶液。混匀后迅速加入6孔板中,每孔1.5 ml。小心避免产生气泡。
     6、室温静置30 min,待上胶凝固后放入细胞培养箱。
     7、足够的菌落形成所需的时间因每个细胞系而异,通常为21天左右。每星期加两次100 g的培养基以防止干燥。

     参考文献:The Soft Agar Colony Formation Assay  DOI: 10.3791/51998

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