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基因魔剪 CRISPR/Cas9,如何操纵你的小鼠上天入地

小鼠作为生物医学宝贵的研究工具,广泛应用在模拟肿瘤、代谢疾病、神经性疾病等人类疾病的研究过程中。这是因为小鼠和人类的基因组都包含约 22 400 个基因。约 99% 的小鼠基因可以在人类基因组中找到同源基因,小鼠模型对人类疾病治疗具有重大借鉴意义。

     加上近些年魔术剪刀——CRISPR/Cas9 基因编辑技术的出现,让基因编辑小鼠变成了触手可得的科研头牌明星。

     那么这把神奇的剪刀是如何起作用的呢?来看看在基因编辑小鼠中的应用吧。

     第一步  确定修饰的目的基因

     构建小鼠前,需要先明确研究涉及的基因。一般分为 2 种情况:

     1. 研究基因功能:显而易见,在此类研究中涉及的基因是明确的。可以直接利用基因编辑技术修饰小鼠的基因组,从而通过小鼠性状的改变研究其功能。

     2. 研究疾病或是肿瘤:需要先查阅文献,根据疾病特征选择目的基因。大部分非传染性疾病都可以通过基因修饰在小鼠身上模拟。一般来讲,基因编辑鼠作为研究模型是优于药物诱导或细胞移植鼠的,因为基因编辑鼠可以较好地模拟人类疾病发病的过程。

     第二步  确定基因编辑的方式

     在明确了构建涉及的基因后,我们需要确定编辑该基因的方式。基因编辑从功能上一般分为以下几类:基因敲除(Knockout, KO),条件性基因敲除(Conditional Knockout, CKO),基因敲入(Knock-in, KI)。

     ▌基因敲除(Knockout, KO)小鼠

     基本原理:通过基因编辑技术或基因打靶技术将小鼠体内的基因从基因组上删除,或者造成移码突变。具体来说,是把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉,这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物,并能稳定遗传。

     应用:研究某个基因的功能;研究该基因在对小鼠全身生理病理的影响;构建疾病模型等,前提是这个基因必须没有胚胎致死性。

     举例:ApoE-KO 小鼠

     如 ApoE(载脂蛋白 E)基因是参与脂蛋白的转化与代谢过程,而敲除该基因会导致脂蛋白代谢紊乱。ApoE-KO 小鼠会产生粥样硬块,较适合动脉粥样硬化疾病机理和药物研发的研究。

     ▌条件性基因敲除(Conditional Knockout, CKO)小鼠

     研究表明,约 1/3 的小鼠基因对于胚胎发育是必不可少的,即敲除该基因会使小鼠胚胎死亡,不能生长发育。一种 Cre/Loxp 重组的基因编辑系统应运而生,该系统可以人为控制敲除基因的时机或位置,从而在时间上保证小鼠的发育,或是在空间上控制基因敲除的范围。

     基本原理:基于 Cre/Loxp 基因编辑系统。Cre 基因可被具有组织特异性的启动子启动,或在合适的时机人为诱导表达。带有 Loxp 片段的小鼠获得 Cre 酶后,可以在特定的组织或细胞中敲除两端带有 Loxp 片段的目的基因。

          
                                           条件性基因敲除(CKO)原理示意图

     应用:构建在特定组织或细胞中敲除特定基因的敲除鼠;适用于构建具有胚胎致死性的基因敲除鼠;研究基因在特定组织的功能与作用。

     举例:若需要研究某基因 A 在神经系统中的功能,则可以构建 loxp-A-loxp 基因敲除鼠,再与 nestin-Cre 鼠交配,由于 nestin 的启动子具有神经系统特异性,即可得到神经系统条件性敲除 A 基因的鼠。又比如,由于 Kras 基因的敲除导致小鼠胚胎致死,不能正常用于研究。针对这一情况,构建 loxp-Kras-loxp 转基因鼠,在合适的时机人为用 Cre 诱导基因在特异组织敲除,这样就可以方便地研究基因敲除诱发的癌症。

     ▌基因敲入(Knock-in, KI)小鼠

     基本原理:通过基因编辑技术,把外源基因序列敲入到小鼠特定的基因位点,利用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。

          
                                                            基因敲入(KI)原理示意图

     应用:一般而言,导入人源基因可以直接研究该基因的功能,或是构建人类疾病模型;而导入标签基因则可以观察某些特定基因的表达,或是观察细胞、组织的状态;导入鼠源基因则可以观察该基因过表达对小鼠的影响,研究该基因的功能与作用。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选,信号通路的研究等。

     举例:APP-PS1 KI 小鼠

     研究阿兹海默症这一人类神经退行性疾病时,就是通过在小鼠中引入人源的 APP-PS1 基因,从而在小鼠身上模拟了人类的阿兹海默症。

     第三步  小鼠品系的选择

     选择适合研究目的和方法的基因编辑方式后,也需要选择合适的小鼠品系。基因编辑鼠的品系我们一般选择 C57BL/6。因为其具有以下特点:

     品系稳定,常被认作「标准」的近交系,为许多突变基因提供遗传背景;易于繁殖;
     C57BL/6 小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

     出于以上的原因,C57BL/6 小鼠被广泛应用于基因编辑模型的建立以及肿瘤学、生理学、遗传学等方面研究。

     C57BL/6 小鼠

     当然另外还有很多小鼠品系也用于基因编辑,如 DBA、BALB/c、BALB/c-Nude 或 129S 等,虽然说一般情况下会选择 C57BL/6,不过也要根据不同小鼠品系的基因表达及性状特征来决定。

     第四步  基因编辑小鼠的构建

     根据上面步骤,我们大概能合适地选择某种基因敲除或敲入的小鼠模型。现有的小鼠基因编辑技术包括 ES 基因打靶,ZFNs 和 TALEN 技术以及近期热门的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术。就现在最快捷的 CRISPR/Cas9 技术而言,2 个月内即可获得 F0 代转基因鼠,4 个月内可获得 F1 代小鼠。

     构建一种基因编辑鼠基本步骤:确定基因、设计 sgRNA、构建 sgRNA、显微注射、产仔与鉴定、繁殖等一系列步骤。因此,若该基因编辑小鼠是现有的,那便省了许多麻烦,可以通过购买、赠送的方式获得。

     但很多时候需要构建新的基因编辑鼠,如果你自己掌握这项本事固然是好,如果时间紧迫,此时寻求第三方机构的帮助或许是个更好主意,因为第三方机构专注于构建基因编辑鼠,具备更成熟的操作和技术,是节约时间和成本的最佳方案。

     目前邦耀实验室已经成熟掌握利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术,并且成功构建了多种基因敲除、敲入及条件性敲除模型,如果您的实验需要基因编辑鼠或者您有相关问题,欢迎与我们联系!
      

(文章来源网络)

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