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实验专栏丨拟南芥幼苗蛋白免疫共沉淀实验步骤!
一、 拟南芥幼苗蛋白免疫共沉淀为例详解实验步骤:
1、 拟南芥幼苗在液氮中充分研磨
2、 将粉沫转入到预先加入了3倍体积的细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)小烧杯中 , 冰上轻轻搅拌,让其在冰上融化,后转入离心管中,4℃,13000rpm离心20min,上清转移至新管
3、 加入1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads, 轻轻转动4℃孵育1h
4、 4℃,4000rpm离心5min , 将蛋白抗体磁珠复合物离心至管底,弃上清
5、 用裂解缓冲液清洗两次,弃去上清,最后一次上清一定要尽量去干净
6、 加入45ulLSDS loading Buffer,沸水中煮5min , 冷却到室温后离心,上清液进行SDS-PAGE,WesternBloting及下游实验检测。


二、注意事项:

1、 样品处理的质量决定抗原抗体反应中抗原的质量,需要控制所有操作在冰上或4℃;
2、 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,防止蛋白降解。多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。针对不同的实验目的和蛋白质特性选择不同的裂解液。
3、 实验时需要使用对照抗体包括阴性和阳性,阴性对照一般是同种属的IgG,阳性对照可以选用已知的细胞内某种蛋白抗体。

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