近期后台咨询ELISA实验的用户较多，中洪君（微信：zhby13）将实验操作中可能会遇上的问题进行综合整理推送。如有其他疑问欢迎后台留言或找我私聊。

   ELISA实验因灵敏度高，特异性强在生物科研上得到了广泛的认可，但对初学者而言，如不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对最终的实验结果产生比较大的影响，比如实验出现白板，显色弱灵敏度低，花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。

1.白板现象

   在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。

   出现该现象的可能原因：

   试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。

   错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。

   洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。

   配置稀释液的蒸馏水可能被污染。

   洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。

   酶标记物的活性和效价比较低。

   溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。

2.显色弱灵敏度低

   在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。

   出现该现象的可能原因：

   产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。

   试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。

   少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。

   洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。

   孵育时间和孵育温度未达到实验要求。

   洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。

   底物溶液TMB显色时间太短。

3.花板无梯度背景高

   在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高，。

   出现该现象的可能原因：

   底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。

   孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。

   没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。

   加样时没有换枪头造成交叉污染。

   花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被板子的问题。

综上所述

       在ELISA实验中应注意以下问题：

   1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。

   2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。

   3.试剂保存：蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度，显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。

   4.各试剂在使用前应充分混匀，以保证试剂的均一性和准确性。

   5.严格控制反应温度和反应试剂。

   6.洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，洗板的力度都是应该注意的问题。

   7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之间。

   8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。

   9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。

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