1. 悬浮细胞的分离方法

   1) 将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。

   2) 去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。

   3) 用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。

   4) 如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

兔髓核分离中洪实拍操作图

2. 实体组织材料的分离方法

   1）机械分散法

   a. 纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
   b. 用PBS清洗两次后
   ①用吸管吹打，分散组织细胞。
   ②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
   ③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
   c. 收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
   d. 去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。

   2）消化分离法

   酶消化分离法（过夜冷消化法）
   a. 细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
   b. 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
   c. 加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
   d. 次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
   e. 加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

   3）非酶消化法（EDTA消化法）

   a. 把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
   b. 将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
   c. 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
   d. 弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
   e. 用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

神经胶质中洪实拍操作图

常见问题解答：

   Q：为什么我取得原代肿瘤组织，分离的却不是肿瘤细胞？

   A：取材时，我们要熟悉所需组织的类型和部位特征，选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

   Q：若是细胞中混成纤维细胞，如何去除？

   A：成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快，可利用反复贴壁法使二者分离，进而达到清除成纤维细胞的目的。

   Q：为什么离心后，没有细胞分离出来？

   A：需要考虑消化酶的因素，由于肿瘤组织较致密，胰酶无法消化，一般选用胶原酶，如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法，如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别：

   注：胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。

   Q：消化时间如何确定？

   A：具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。

   Q：消化之前为什么用EDTA?

   A：EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后，形成的机械力可使细胞分散。

   Q：细胞量太少，长不起来怎么办？

   A：有几种办法，如对没消化完的组织块反复消化，尽量多收集一些细胞；并且尽量传代到小皿里，如6孔板都可以。若是细胞仍太少，应耐心等待，尽量不要传代，只换液。

   Q：细胞难以贴壁？

   A：尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁，可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。

   Q：肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里？

   A：培养基一般选用RPM1640，DMEM等，建议最好能加入促生长的物质：如胰岛素、氢化可的松、雌激素、EGF等因子。