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玩转miRNA表达检测,全靠这篇文!

       要了解miRNA在生物发生发展和基因表达调控中扮演的角色,最基本和最关键的是如何迅速、准确地定量检测miRNA的表达。但是由于成熟miRNA的长度非常短,且部分miRNA表达水平可能很低,必须采用适宜、灵敏的检测方法和分析工具。目前常用的方法包括定量real-time PCR、深度测序和微芯片。每种方法都有其各自的优缺点,下文会为您详细说明。


荧光定量PCR引物探针设计


       反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物),上游引物为特异性引物,在miRNA上设计,反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物),上游引物为特异性引物,在miRNA上设计,若GC含量太低,可以在上游引物5’端加入GCGC等保护碱基,下游引物为通用引物,与RT引物的某一段相匹配。


       荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需调整引物浓度,提高引物扩增效率,尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针,探针设计位置可以有3种:完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。至于探针要设计在哪个位置,可根据自己的实验情况来定。


具体实验操作流程


1.RNA提取

       针对茎环状结构RT引物,RNA正常提取就好;对于Oligod(T)特异的RT引物,尽量用特殊试剂盒提取miRNA。


2.反转录

       反转录过程对酶没有特殊要求,操作按照反转录酶的说明书进行。对于引物,在反转录过程中只需加入Oligod(T)特异的RT引物或茎环状结构RT引物,不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特异的RT引物时,RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。

       内参基因不需要单独设计RT引物,可以用荧光定量PCR的反向引物作为RT引物。


3.荧光定量PCR

       先优化PCR体系(引物浓度、退火温度等),进行引物测试,确保扩增曲线正常且溶解曲线为单一的尖峰,阴性对照无扩增,则引物测试合格,再进行后续实验(常规操作)。


二代测序/RNA-seq


       毫无疑问,NGS将成为miRNA研究的主要方法。NGS的成本和所需时间已经显著下降,miRNA-seq对于很多实验室来说已不再高不可攀。NGS不会单纯取代其他技术,而是会与其他技术结合使用。测序结果需要验证,qPCR的可靠性使其成为结果验证的理想选择。当实验需要序列信息时,如发现新型miRNA、探寻isomiRs的影响、或区分miRNA与其他相似RNA序列,miRNA测序法便成为研究人员的不二之选。


3、芯片(microarrays)


       是一种较快的检测miRNA表达的方法。芯片分析也是基于杂交的原理,采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交,通过荧光扫描获得表达图谱,借助相应软件进行miRNA的表达分析。通过测定特定过程中miRNA的表达水平,来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。



       芯片法能够对一个样本中的多种miRNA同时进行分析(1)。微芯片的优势在于对miRNA的种类覆盖度和定制化检测。然而,其劣势包括:


       ● 微芯片为半定量方法。因此尽管这种方法能比较不同细胞状态的miRNA相对表达水平,但需要另外验证,进行定量,验证方法包括RT-qPCR

       ● 此类实验需要特定仪器和软件

       ● 这种方法只能用于已知种类的miRNA

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