lncRNA测序采用 Illumina HiSeq 平台进行测序，针对有参考基因组样本开展准确的 lncRNA 鉴定和 lncRNA 靶基因预测，同时提供针对测序数据中 mRNA 的分析，结果更全面，广泛应用于医学、农学研究领域。近年来研究人员对lncRNA的关注度仍是热火朝天，2017年发表lncRNA相关的文章高达2748篇，而今年1月就已经发表380篇，预示着lncRNA在2018年还会大爆发。

   为了让各位小伙伴更好的掌握lncRNA测序相关信息，中洪君（ID：boyuan6668）特综合各大“疑难杂症”逐一击破。

1、做lncRNA测序前需考虑什么问题？

   在做lncRNA测序之前，除了生物学重复，样品设置（关于样品设置在昨天中洪君已经推送过：链接）等基本问题需要考虑外，有两个关键点是我们必须要注意的：

实验建库环节：

   是否有此物种rRNA去除的试剂盒（并不是所有的物种都已有成熟的rRNA去除试剂盒）；

信息分析环节：

   是否有研究物种组装版本较好的参考基因组（建议染色体组装水平）及注释信息完整的注释文件。

2、lncRNA建库测序对样品有什么要求呢？

   lncRNA测序样品重点关注其完整性，总量，浓度及纯度，要求如下：

       ）1、样品类型

       RNA类样品，完整且无外源污染

        ）2、样品量

      人、鼠类样品≥2µg，其他物种样品≥5µg

       ）3、样品浓度

       ≥200ng/µl

   另外，需注意培养的细胞类样品是否存在支原体污染，建议提前做好样品支原体污染检测，避免测序结果因支原体RNA数据残留，而影响数据质量及分析结果。

3、利用lncRNA测序技术可以挖掘哪些信息？

   可以从两个方面分析这个问题。

1、实验角度

   采用的文库是去除rRNA的链特异性文库，一次建库测序可同时获取mRNA，lncRNA及cricRNA的数据信息，可对原始测序数据进行充分挖掘，全方位研究分子调控机制等。

2、分析角度

   可同时分析样本中的lncRNA和mRNA表达量，不仅可以鉴定特异表达的lncRNA和发现新lncRNA，更可开展后续关联性分析，靶标预测，深入挖掘基因调控机制，广泛应用于发育调控、疾病标记物的寻找、药物靶点筛选等领域。

4、RNA-seq测序得到了显著差异表达的lncRNA，后续可设计哪些验证方法？

   对于目标lncRNA验证可从多个层面开展，如基本的表达量验证，对lncRNA发挥的调控功能验证，或对其互作方面验证，具体方法可参考下图。

5、如果lncRNA位于不同的细胞定位，在做基因沉默的时候应该用什么策略？

   lncRNA的作用机制非常复杂，如细胞核中的lncRNA可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达，还能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控；而细胞质中的lncRNA则可通过ceRNA调控机制，参与靶基因的表达调控。

   细胞定位对研究lncRNA功能来说至关重要，对于不同细胞定位的RNA分子，在做基因沉默时可采用的策略有：

       1、当lncRNA位于细胞质的时候，用RNAi；

       2、当lncRNA位于细胞核的时候，用寡核苷酸反义RNA（antisense oligonucleotides ，ASOs ）；

        3、当lncRNA在细胞质和细胞核都定位的时候，两种方法都可以。

6、如何预测LncRNA的靶基因？

   lncRNA具有复杂的作用模式，除顺式（cis）和反式（trans）作用外，还可与DNA、RNA和蛋白等不同的分子结合发挥作用，从转录及转录后水平发挥作用。

lncRNA的靶基因预测主要包含：

       1、根据顺式（cis）的作用模式来预测；

       2、根据lncRNA结合的核酸序列来预测，如预测工具lncRNATargets等；

       3、根据蛋白的结合特性来预测，如预测工具RBPDB等。

7、如果想自行尝试对测序鉴定到的lncRNA进行分析，常用lncRNA有关的数据库有哪些？

如下表展示的是一些常用数据库，可根据每个数据库的特点，进行适当选用。

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