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如何提高lncRNA测序技能?主要从这7个方面着手

   lncRNA测序采用 Illumina HiSeq 平台进行测序,针对有参考基因组样本开展准确的 lncRNA 鉴定和 lncRNA 靶基因预测,同时提供针对测序数据中 mRNA 的分析,结果更全面,广泛应用于医学、农学研究领域。近年来研究人员对lncRNA的关注度仍是热火朝天,2017年发表lncRNA相关的文章高达2748篇,而今年1月就已经发表380篇,预示着lncRNA在2018年还会大爆发。


   为了让各位小伙伴更好的掌握lncRNA测序相关信息,中洪君(ID:boyuan6668)特综合各大“疑难杂症”逐一击破。


1、做lncRNA测序前需考虑什么问题?


   在做lncRNA测序之前,除了生物学重复,样品设置(关于样品设置在昨天中洪君已经推送过:链接)等基本问题需要考虑外,有两个关键点是我们必须要注意的:


实验建库环节:

   是否有此物种rRNA去除的试剂盒(并不是所有的物种都已有成熟的rRNA去除试剂盒);


信息分析环节:

   是否有研究物种组装版本较好的参考基因组(建议染色体组装水平)及注释信息完整的注释文件。


2、lncRNA建库测序对样品有什么要求呢?


   lncRNA测序样品重点关注其完整性,总量,浓度及纯度,要求如下:


       )1、样品类型

       RNA类样品,完整且无外源污染

        )2、样品量

      人、鼠类样品≥2µg,其他物种样品≥5µg

       )3、样品浓度

       ≥200ng/µl


   另外,需注意培养的细胞类样品是否存在支原体污染,建议提前做好样品支原体污染检测,避免测序结果因支原体RNA数据残留,而影响数据质量及分析结果。


3、利用lncRNA测序技术可以挖掘哪些信息?


   可以从两个方面分析这个问题。


1、实验角度

   采用的文库是去除rRNA的链特异性文库,一次建库测序可同时获取mRNA,lncRNA及cricRNA的数据信息,可对原始测序数据进行充分挖掘,全方位研究分子调控机制等。


2、分析角度

   可同时分析样本中的lncRNA和mRNA表达量,不仅可以鉴定特异表达的lncRNA和发现新lncRNA,更可开展后续关联性分析,靶标预测,深入挖掘基因调控机制,广泛应用于发育调控、疾病标记物的寻找、药物靶点筛选等领域。



4、RNA-seq测序得到了显著差异表达的lncRNA,后续可设计哪些验证方法?


   对于目标lncRNA验证可从多个层面开展,如基本的表达量验证,对lncRNA发挥的调控功能验证,或对其互作方面验证,具体方法可参考下图。



5、如果lncRNA位于不同的细胞定位,在做基因沉默的时候应该用什么策略?


   lncRNA的作用机制非常复杂,如细胞核中的lncRNA可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达,还能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控;而细胞质中的lncRNA则可通过ceRNA调控机制,参与靶基因的表达调控。


   细胞定位对研究lncRNA功能来说至关重要,对于不同细胞定位的RNA分子,在做基因沉默时可采用的策略有:


       1、当lncRNA位于细胞质的时候,用RNAi;


       2、当lncRNA位于细胞核的时候,用寡核苷酸反义RNA(antisense oligonucleotides ,ASOs );


        3、当lncRNA在细胞质和细胞核都定位的时候,两种方法都可以。


6、如何预测LncRNA的靶基因?


   lncRNA具有复杂的作用模式,除顺式(cis)和反式(trans)作用外,还可与DNA、RNA和蛋白等不同的分子结合发挥作用,从转录及转录后水平发挥作用。


lncRNA的靶基因预测主要包含:


       1、根据顺式(cis)的作用模式来预测;


       2、根据lncRNA结合的核酸序列来预测,如预测工具lncRNATargets等;


       3、根据蛋白的结合特性来预测,如预测工具RBPDB等。



7、如果想自行尝试对测序鉴定到的lncRNA进行分析,常用lncRNA有关的数据库有哪些?


如下表展示的是一些常用数据库,可根据每个数据库的特点,进行适当选用。



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