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免疫组化中如何防止脱片?

   听到很多人抱怨,在免疫组化实际操作中遭遇过组织易脱片的问题,为此我们探讨了多聚赖氨酸较好的涂胶方法,又进一步对三种粘附剂即APES(氨醛三已氧基硅烷),多聚赖氨酸和白乳胶的防脱片效果和染色情况作了比较,成功地总结出多聚赖氨酸双涂胶法。现介绍如下:


一、材料和方法


1、标本:取自河北省第四医院外科的食管癌病例标本。


2、主要试剂和仪器:小鼠抗人单克隆抗体(本室制备,可与人体组织发生强阳性反应)、生物素标记羊抗小鼠二抗、辣根酶标记链亲和素、DAB、APES、多聚赖氨酸、白乳胶、HPIAS-1000高清晰度彩色病理系统。


3、方法


3.1 涂粘附剂:

   选择质地均匀的玻片

   (25.4mm×76.2mm),洗衣粉煮,自来水冲,浸泡重铬酸清洁液24h,自来水和蒸馏水冲洗,晾干备用。用三种粘附剂即APES,多聚赖氨酸和白乳胶涂胶。APES用丙酮做1:50稀释,按说明书操作涂胶。白乳胶按涂胶。


多聚赖氨酸的涂胶包括以下2种方法:

   ① 单涂胶:往一张玻片上加一定浓度和体积的多聚赖氨酸应用液,用另一张玻片推片,然后叠加其上。停留5min,中间推动玻片数次,使液体涂抹均匀。分开两张玻片,滤纸吸干玻片下缘,置玻片架上60℃烤干1h,备用。


   ② 双涂胶:往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80μl单涂胶,60℃烤干1h,同样方法重复涂胶1次,60℃烤干1h,备用。


3.2 切片

   食管癌组织固定,石蜡包埋。每组实验选用同一病人的肿瘤组织标本5μm切片。展片水采用蒸馏水。


3.3 免疫组化染色

   常规脱蜡至水,柠檬酸缓冲液煮沸法行抗原修复,3%双氧水阻断内源性过氧化物酶10min。10%正常山羊血清封闭10min。倾去血清,滴加小鼠抗人单克隆抗体,每张切片滴加50μl,以PBS代替一抗作为阴性对照,室温60min。滴加二抗,用量同一抗,室温45min。滴加辣根酶标记链亲和素(5μg/ml),用量同一抗,室温30min。DAB显色2min,常规脱水,中性树胶封片。


3.4 统计脱片情况

   分为三个等级:① 轻度脱片:切片边缘轻度卷曲至脱落面积<10%;② 中度脱片:切片脱落面积>10%,<80%;③ 重度脱片:切片脱落面积>80%。


   脱片指切片从载玻片上脱下或切片已与载玻片分离,悬浮但尚未脱下。


3.5 图象分析

   HPIAS-1000高清晰度彩色病理系统登录后,画测量每张切片染色强度,取平均光度值记为OD值。二、结果1多聚赖氨酸不同涂胶方法防脱片效果的比较1.1 相同浓度不同体积多聚赖氨酸的比较0.01%多聚赖氨酸40μl,80μl,120μl,160μl四种不同体积单涂胶,结果见表1。40μl的多聚赖氨酸用量过少,不易涂匀,防脱片效果较差。120μl以上多聚赖氨酸用量过大,涂胶时易溢出,使涂胶不匀,防脱片效果不理想。多聚赖氨酸的用量以80μl为佳。


二、结果:


   表1 相同浓度不同体积多聚赖氨酸的防脱片效果比较:


1.2 同量多聚赖氨酸不同浓度涂胶的比较


   0.02%多聚赖氨酸40μl、0.0133%多聚赖氨酸60μl、0.01%多聚赖氨酸80μl单涂胶,结果见表2。以0.01%多聚赖氨酸80μl涂胶防脱片效果最佳。

   表2 同量多聚赖氨酸不同浓度涂胶的防脱片效果比较:


1.3 单涂胶和双涂胶的比较


   0.01%多聚赖氨酸80μl单涂胶仍然存在切片轻、中度脱落的现象,又探讨用双涂胶的方法提高防脱片效果,结果见表3。两组进行卡方检验,双涂胶组完整贴片百分率显着高于单涂胶组(P<0.01),整体的防脱片效果较单涂胶组好,中、重度脱片均为0,轻度脱片也较单涂胶组低。多次的实验结果显示,双涂胶防脱片效果稳定,除仅有少许的切片边缘轻度卷曲外,已无切片部分或全部脱落现象。

   表3 单涂胶和双涂胶的防脱片效果比较


注:

   ①为0.01%多聚赖氨酸80μl单涂胶,为4次实验的结果;


   ②为6次实验的结果。2不同粘附剂防脱片效果的比较用3种粘附剂涂胶(多聚赖氨酸为双涂胶法涂胶),结果见表4。运用卡方分割法,结果表明,APES组和白乳胶组完整贴片百分率的差异无显着性(P>0.05),两组均不能获得高比例的完整贴片,且均有一定比例的中度脱片,防脱片效果较差。多聚赖氨酸双涂胶组的完整贴片百分率显着高于APES组和白乳胶组(P<0.01),中、重度脱片为0,防脱片效果较好。


   表4 不同粘附剂的防脱片效果比较:


三、讨论多聚赖氨酸分子结构中具有多个阳离子基团,可与组织上阴离子紧密结合,起到防脱片效果。


   多聚赖氨酸目前的涂胶方法通常为浸泡法,按说明书的涂胶方法,每次需配制1L的应用液,涂胶时放入干净的玻片浸泡,一次一架。但是由于一般实验室用量较小,通常是配制少量多聚赖氨酸应用液,逐张浸泡。这种方法前后的涂胶不能完全一致,容易造成涂胶不均匀,起不到应有的防脱片效果。本文中比较了几种定量的多聚赖氨酸涂胶方法,0.01%多聚赖氨酸40μl,80μl,120μl,160μl涂胶中以80μl为好,120μl以上由于液体过多容易导致流失。同量多聚赖氨酸不同浓度涂胶也表明0.01%浓度80μl为好。0.01%多聚赖氨酸80μl单涂胶的防脱片效果虽然较好,但实验中仍会出现少数标本部分脱落现象。故将单涂胶的方法加以改进,即对同一玻片涂2次胶,称为双涂胶。双涂胶的切片染色后未见中、重度脱片,可以起到最好的防脱片效果。又将多聚赖氨酸双涂胶和APES、白乳胶进行比较,结果发现多聚赖氨酸双涂胶防脱片效果显着好于后两者。


   多聚赖氨酸和APES涂胶阳性染色强度虽然低于白乳胶,但是阳性染色OD值/阴性染色OD值却高于白乳胶,前两者从免疫检测特异性上优于白乳胶。多聚赖氨酸双涂胶染色均匀性较单涂胶好,与单涂胶比较染色强度无差异。


   故我们总结出的最好的防脱片方法是多聚赖氨酸双涂胶法,即每两张玻片每次用0.01%多聚赖氨酸80μl涂胶,共涂胶2次。该方法可以有效防止石蜡切片脱落(耐受抗原修复和免疫组化染色的液体浸泡),染色结果准确性高,并且操作简单,重复性好,适合于少量涂胶的实验工作,可在临床和科研中推广应用。


       参考文献〔1〕熊正文,王伯沄,李春光等。提高免疫细胞化学染色的新技术研究及应用。医学研究通讯,2002,30(2):36-38.〔2〕倪灿荣。影响免疫组织化学染色结果的各种因素。中华病理学杂志,1996,25(6):383-384.〔3〕顾长芳。应用压力锅和微波炉法进行石蜡切片抗原修复的比较。中华病理学杂志,1996,25(6):377-378.〔4〕贺占国。缓冲液pH值对免疫组化染色的影响。临床与实验病理学杂志,1996,12(4):365-366.〔5〕李科。高压处理技术在免疫组化中的应用。临床与实验病理学杂志,1996,12(3):265.〔6〕丁俊义,林国宏,高英贤。免疫组化染色粘附剂和脱蜡方法的改进。中国医科大学学报,1994,23(2):182.〔7〕张芸,文晓笛,刘健。石蜡切片后粘胶技术在免疫组化染色中的应用。临床与实验病理学杂志,2002,18(4):436.〔8〕徐飞,王亚丽。乳白胶作为粘片剂的应用。诊断病理学杂志,1999,6(4):264.


   ▋作者:唐洁,侯洁,韩丽枝,宋淑霞,吕占军(河北医科大学)

   ▋来源:中国组织化学与细胞化学杂志

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