随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，DNA转染已经逐步不能满足科研的需要，直接转染蛋白质进入细胞不仅节省时间，而且还可以更便捷的应用于活性蛋白和多肽细胞内相互作用、多肽库筛选以及蛋白半衰期研究等。在某些干细胞研究中，直接转染蛋白也具有意想不到的效果。

       转染试剂-蛋白质络合物贴附在带负电荷细胞表面并通过直接与细胞膜融合或胞吞作用及随后的与内涵体融合，将捕获蛋白质释放入细胞质中而进入细胞。 蛋白质高效转染可以用于转染从小分子多肽到超过550kDa的蛋白质。由于形成的络合物是非共价的，因此不会干扰蛋白质的生物学活性。

中洪实验员细胞转染操作图

一、实验材料及试剂

       培养板、CO2培养箱、酒精灯、移液枪等；培养基、药物等。

二、实验内容

       用吸管弃掉旧的培养液，以六孔板为例，根据文献查询药物的作用浓度，配制一个高浓度的原液，然后按照计算添加相应剂量的多肽。

三、注意事项

       1、Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。  复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和 Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外还应该留意，如果研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000。                 

       2、对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。  

       3、还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。  

       4、阳离子脂质体应该在4℃保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌。