酶切，作为一种常用的分子克隆的手段，应用得当，无往不利；应用不当，也是十分棘手。真是让人又爱又恨，酶切最常遇到的问题不是切不动就是切过了头，那么该如何解决？中洪君带大家来瞧瞧！

酶切不动

➤ 切不动可能的原因：

1. 酶不匹配

       解决的方法：如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。

2. 体系的问题

       解决的方法：酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。

3. 酶的量太少

       解决的方法：当设计一个酶切时，限制性内切酶的用量是与DNA分子的大小和量密切相关的。根据每种酶的单位定义，精确计算出所需的限制性内切酶的量。不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“，那个通用酶切方案是很多酶切切不动的原因。

4. 酶失活

       如果限制性内切酶因为保管不当，导致酶失活或部分失活，那么依据3D计算出来的酶量就不能保证完全酶切。解决的方法：保管好你的酶。如果过期了，就不要用了。

5.DNA的问题

       如果制备的质粒DNA的质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等），那么对这种质粒DNA进行酶切时，即使酶活性正常，酶量足够，也不能实现完全酶切，因为其中很多质粒DNA已经变性，不能被切开。

       解决的方法：保证质粒DNA的质量。这里可以参考毛博的上一篇文章《质粒啊质粒，你到底要闹哪样？》

下面，给大家看一个简单的实例：

       如果要用AcsAB + pSB1C3对质粒DNA进行双酶切，以便进行某基因的克隆。

       那么，应该同时设计并进行三种酶切反应：

       A: AcsAB + pSB1C3双酶切

       B: AcsAB单酶切

       C: pSB1C3单酶切

       在酶切时，A，B，C三种酶切反应都用相同的buffer系统，相同的DNA量（建议至少0.5ug）， 所需的酶量用3D进行计算。在合适的温度（37°C）酶切1～2个小时， 然后进行电泳分析。电泳分析时，添加两种对照：未酶切的质粒DNA和分子量标准（Marker）。

       根据电泳的结果，就可以知道酶切是否完全：

       如果一切正常，完全酶切后电泳的条带分布如下：

       单酶切(B和C)应该只有一条线性化的DNA条带，其大小与质粒的理论长度一致；

       未进行酶切的质粒DNA应该主要是一条超螺旋条带，其电泳位置应该在单酶切 产生的线性DNA分子的前面。(有的质粒会在超螺旋条带的后面出现线性化条带和环状DNA条带）；

       双酶切的条带应该只有一条带，而且大小与单切的位置一样(注意：只有当两个酶切位点间没有大片段插入时，才如此。事实上，大部分质粒的多克隆位点都是如此)。

如果出现以下的情况，就表明有问题：

       ➤ 单酶切后（B和/或C），与未酶切的DNA样品(D)的电泳位置一样（即依然为超螺旋）

       ➤ 出现线性化质粒及超螺旋质粒两条带。

       这意味着：AcsAB和/或pSB1C3未能完全切开，原因可能是酶部分失活，或者质粒的质量有问题。 此时，即使双酶切只出现一条线性化DNA条带，也可能在线性化质粒中存在大量的单酶切的载体。

       用此种载体进行克隆，则在连接时会出现大量的单酶切载体的自连（载体自连的效率较双片段连接高10倍以上），导致大量的自连克隆，很难挑选到有插入的克隆（克隆失败）。如果出现此种现象，建议不要盲目地做下去。应该先停一停，首先逐一查找可能的原因。只有当上述两种可能的问题都解决了，才能保证完全酶切，进而获得正确的克隆。

酶切切过头

       酶切切过头的问题，主要是两个原因导致的，解决办法也是有的——

一、酶切时间过长

       酶切时间过长的确有时候会对目的条带有影响，因为你用的酶可能会有星号活性。那么什么叫星号活性呢？通俗一点讲，就是酶不去切它该切的地方，瞎切一气......酶切时间过长，会导致最后乱切。毛博个人建议：双酶切不要超过5小时。其实一般3-4小时足够了。你应该有提供给你酶的生物试剂公司的相应的说明书的吧？上面都有写明酶的活性和作用时间。现在的酶都很不错的,10到15分钟就可以都切完。我一般只水浴一个小时,不会再长了。

       如果时间太长，就会造成下图所示的情况。注意第四泳道红框标注的地方。居然切出了5根条带。这显然是时间过长了。

二、酶量过多

       和过长的反应时间会造成非特异性的酶切（星号活性）一样，酶加多了也会产生星号活性。一般来说，所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。

       以TAKARA的酶为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15 U/μl。在除外酶降解的因素外，理论上，该酶可分解15μg的DNA。而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量非常好，酶切也完全切得动。注意，不要加多了呀。

       但是公司给推荐的一般都是20ul体系加1ul。可是有的时候为了省酶，在20ul只加0.5ul酶，切的效果也很好。

       其实，除了考虑酶浓度（每ul多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在λ DNA上的酶切位点数目。比如用Hinc Ⅱ和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在λDNA上的酶切位点分别是35个和1个。根据酶活性的定义，相同单位的Hinc Ⅱ和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的Hinc Ⅱ显然应该要少很多。 毛博举这个例子，是想说明：大家再考虑酶浓度的时候，应该多想一层。

       综上所述，酶切切过头了的原因，其实并没有酶切切不动那么复杂。不外乎时间过长和酶量太大。小伙伴们只要注意一些，一般都没有问题。

双酶切设计软件推荐

       最后给大家推荐一个很实用的工具：双酶切设计软件Double Digestion Designer——

 

       网上有一个在线的分子生物学工具，可以很方便的决心双酶切设计，可以精确的给出酶切时需要的酶量，而且能够推荐最合适的buffer。实用很方便，常用的几个限制性内切酶供应商的酶都能计算（包括NEB,Takara,MBI)。而且该软件还有限制性内切酶的搜索功能，可以利用酶的名字，识别序列，粘性末端序列等进行搜索，而且还可以搜索酶的完全同切酶(isoschizomer)和不完全同切酶（Neoschizomer)。即使是分子生物学高手，也可以用该软件辅助进行载体的设计和改造工作。

       该软件界面和简单，使用方便。现在可以免费使用，用户名和密码都是test，大家可以收藏备用。以下是该工具的连接：

http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php