第一天

 

以0.1M NaHCO3（pH 8.6）制备100mg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。

 

在每孔内加入1.5ml靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。

 

在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。

 

第二天

 

将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。

 

将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。

 

去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以免交叉污染）。

 

用1ml TBST稀释4′1010噬菌体（10ml原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10~60min。

 

以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。

 

以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。

 

用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（~100mg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10~60min。将洗脱液转入微量离心管中。

 

10a.或使用通用缓冲液，0.2M的甘氨酸-盐酸（pH 2.2），1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱物转入微量离心管中，以150ml 1M Tris-HCl（pH 9.1）中和。

 

取小量洗脱液（~1ml）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。

 

将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。

 

将培养物转入微量离心管中，4℃，10，000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。

 

将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。

 

第三天

 

4℃，10，000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。

 

用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。

 

将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15~60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。

 

用200ml TBS，0.02%NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。

 

测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4℃。

 

包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1~3。

 

第四和第五天

 

计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1-2′1011 pfu的噬菌体体积。如果滴度太低，在筛选时可采用对应于109 pfu的噬菌体体积。

 

进行第二轮筛选：重复步骤4~18，用含1-2′1011 pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5%。

 

测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。

 

包被平皿进行第三轮筛选，步骤1~3。

 

第六天

 

进行第三轮筛选：用第二轮扩增洗脱液中1-2′1011 pfu噬菌体进行筛选，洗涤时，Tween20的浓度仍为0.5%。

 

测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选 则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序：平板的孵育时间不得长于18h，因为时间过长可能造成噬菌体感染率下降。将剩余的洗脱物保存于4℃。

 

选取单克隆ER2537过夜培养。

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