粘附实验

细胞粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs) 是一类膜表面糖蛋白,它们以配体-受体特异性结合的方式介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的相互接触和结合并调节细胞功能,在胚胎发育和分化、正常组织结构的维持、炎症反应、免疫应答、凝血和血栓形成、创伤修复、肿瘤浸润与转移等许多生理和病理过程中发挥重要的生物学作用。层粘连蛋白LN和层粘连蛋白FN是常用的用于细胞粘附能力检测两种蛋白,多数肿瘤细胞对于上述蛋白具有较强的粘附能力,以LN或FN蛋白预先包被96孔板,按照实验设计将一定量的细胞铺至孔底部,继续培养细胞至实验设定时间,取出培养板,洗去未粘附至孔底的细胞,剩余细胞行进行苏木素或结晶紫染色,以酶标仪测定各孔读数,读数高低与细胞粘附能力成正比。本实验主要用于判定细胞在经过各种药物处理、基因转染、敲除或培养条件改变后,细胞的粘附能力改变情况。

(一)实验材料及试剂

96孔培养板、倒置显微镜、酒精灯、移液枪、CO2培养箱、酶联仪等;As2O3、FN、MTT等。

(二)实验内容

取70μg/ml的FN包装96孔板,每孔30μl,在超净台风干后放入4℃冰箱中备用。实验时取1× 106/ml的细胞接种于已包被FN的96孔培养板中,每孔100μl,设4复孔,待细胞贴壁后(4~5h),加入浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml的As2O3注射液100μl,对照加入100μl培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱内分别孵育20、40、60、120min,吸出培养液,每孔加入5mg/ml的MTT20μl,继续培养4h,弃去全部上清,每孔加入100μl 0.04mol/L盐酸异丙醇,微型振荡器振荡5~10min,使结晶完全溶解,在酶联仪波长570nm处测出各孔吸光度值(OD),以OD值代表黏附细胞数,按下列公式计算细胞黏附抑制率:抑制率(%)=〔1-(加药孔平均OD值-空白孔平均OD值)/对照孔平均OD值-空白孔平均OD值)〕× 100%。

(三)注意事项

       1、细胞浓度或细胞数。

       2、粘附时间多长时间。

       3、粘附后方法的选择:即选用什么方法来确定细胞粘附效果,有染色,显微镜计数,荧光分析等。

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