从动物肝脏中提取DNA
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-05-03
一、原理 ：
在浓氯化钠（1―2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA或（RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿―异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。
为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）
二、实验材料与仪器 ：
1、小白鼠肝脏
2、匀浆器
3、离心机5000r/min
4、量筒50ml（×1），25 ml（×1），10 ml（×1）
5、 吸管5 ml（×2）
6、水浴锅
7、真空干燥器
三、试剂 ：
1．5 mol/L NaCl 溶液：将292.3g NaCl 溶于水，稀释至1000ml。
2．0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液： 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA―Na 于蒸馏水，稀释至1000ml。
3．25% SDS 溶液： 溶25g 十二烷基硫酸钠于100ml 45% 乙醇
4．0.015 mol/L NaCL―0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液： 氯化钠 0.828 g 及柠檬酸三钠0.341g 溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
5．氯仿―异戊醇混合液：氯仿：异戊醇=24：1（V/V）。
6．1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
7．3 mol/L乙醇钠―0.001 mol/L EDTA―Na溶液： 称取乙酸钠 408 g，EDTA―Na 0.372g 溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
8．70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，无水乙醇。
9．二苯胺试剂
10．1 mol/L过氯酸溶液：将10ml过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110ml。
四、操作 ：
1． DNA的分离纯化：
（1）将10头小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液洗去血浆，剪碎，加入50ml 0.14mol/L NaCl―0.15mol/l EDTA溶液，置匀浆器中研磨，待磨成糊状后，将糊状物离心10分钟（4000r/min），弃去上清液，沉淀用0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次，所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
（2）向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液，使总体积为44ml，然后滴加25% SDS溶液 3ml，边加边搅拌，加毕，置60水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变的粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。
（3）加入5mol/LNaCL10ml，使NaCl 最终浓度达到1mol/L，搅拌10分钟，加入月约一倍体积的氯仿―异戊醇混合溶液，振摇20分钟，离心10分钟（4000r/min）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5―2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。
（4）将DNA粗品置于27ml 0.015 mol/L NaCl ―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml 1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液，搅匀,加入一倍体积氯仿―异戊醇混合液，振摇十分钟，离心（4000r/min，10分钟），倾出上层液体（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复处理一次。
（5）将上步所得沉淀于27ml 0.015 mol/L NaCl―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用70%，80%，95%以及无水乙醇各洗一次，真空干燥。
在浓氯化钠（1―2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA或（RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿―异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。
为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）
二、实验材料与仪器 ：
1、小白鼠肝脏
2、匀浆器
3、离心机5000r/min
4、量筒50ml（×1），25 ml（×1），10 ml（×1）
5、 吸管5 ml（×2）
6、水浴锅
7、真空干燥器
三、试剂 ：
1．5 mol/L NaCl 溶液：将292.3g NaCl 溶于水，稀释至1000ml。
2．0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液： 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA―Na 于蒸馏水，稀释至1000ml。
3．25% SDS 溶液： 溶25g 十二烷基硫酸钠于100ml 45% 乙醇
4．0.015 mol/L NaCL―0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液： 氯化钠 0.828 g 及柠檬酸三钠0.341g 溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
5．氯仿―异戊醇混合液：氯仿：异戊醇=24：1（V/V）。
6．1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
7．3 mol/L乙醇钠―0.001 mol/L EDTA―Na溶液： 称取乙酸钠 408 g，EDTA―Na 0.372g 溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
8．70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，无水乙醇。
9．二苯胺试剂
10．1 mol/L过氯酸溶液：将10ml过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110ml。
四、操作 ：
1． DNA的分离纯化：
（1）将10头小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液洗去血浆，剪碎，加入50ml 0.14mol/L NaCl―0.15mol/l EDTA溶液，置匀浆器中研磨，待磨成糊状后，将糊状物离心10分钟（4000r/min），弃去上清液，沉淀用0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次，所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
（2）向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液，使总体积为44ml，然后滴加25% SDS溶液 3ml，边加边搅拌，加毕，置60水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变的粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。
（3）加入5mol/LNaCL10ml，使NaCl 最终浓度达到1mol/L，搅拌10分钟，加入月约一倍体积的氯仿―异戊醇混合溶液，振摇20分钟，离心10分钟（4000r/min）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5―2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。
（4）将DNA粗品置于27ml 0.015 mol/L NaCl ―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml 1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液，搅匀,加入一倍体积氯仿―异戊醇混合液，振摇十分钟，离心（4000r/min，10分钟），倾出上层液体（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复处理一次。
（5）将上步所得沉淀于27ml 0.015 mol/L NaCl―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用70%，80%，95%以及无水乙醇各洗一次，真空干燥。
2． 鉴定： 用二苯胺法测定DNA。
此文转载来源 ：丁香通
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