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基因芯片技术四

 (2)激光扫描共焦显微镜      

       激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似,但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测,而无须清洗掉未杂交分子,从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix公司的SPAForder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中,芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下,与样品池溶液直接接触,并与DNA样品杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时,既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光,也有样品地中DNA所发出的荧光,如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率,可以在接受芯片表面荧光信号的同时,避开样品池中荧光信号的影响。一般采用氩离子激光器(488nm)作为激发光源,经物镜聚焦,从芯片背面入射,聚集于芯片与靶分子溶液接触面。杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集,并经滤波片滤波,被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理,成像分析。在光电信增管前放置一共焦小孔,用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号,避免其对探测结果的影响。激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径,使之能够只照射在单个探针上。通过计算机控制激光束或样品池的移动,便可实现对芯片的二维扫描,移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配,在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高,扫描时间长,比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机,整套系统约 12万美元。


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