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氢氧化甲基汞琼脂糖凝胶电泳

       氢氧化甲基汞和 RNA 中的尿嘧啶和鸟嘌呤上的亚胺键可发生反应,而这些键涉及到 Watson-Crick 碱基配对。因此,氢氧化甲基汞是一种有效的变性剂,能破坏 RNA 的二级结构.在氢氧化甲基汞存在时,RNA 的电泳迁移率是其分子质量的 1g 对数的反函数。由于氢氧化甲基汞可与丙烯酰胺聚合反应中所需的自由基发生反应,因此不能用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

 

试剂、试剂盒

       4X 甲基汞凝胶电泳缓冲液   2X 凝胶加样缓冲液   溴化乙锭   乙酸铵溶液


仪器、耗材

       水平电泳装置   水浴


实验步骤

(一)材料与设备

      1) 水平电泳装置。

      2) 水浴

      3)4X 甲基汞凝胶电泳缓冲液:200 mmol/L 硼酸,20 mmool/LN2B4O7.H2O,40 mmol/LNa2S04(pH8.0)

      4)2X 凝胶加样缓冲液:

      lmol/L 氢氧化甲基汞                                25u1

      4X 甲基汞凝胶电泳缓冲液                      500ul

      甘油                                                        200ul

      溴酚蓝                                                     2ug

      5)0.5ug/ml 溴化乙锭

      6)0.lmol/L 乙酸铵溶液


(二)操作方法

      1) 制备凝胶:大于或等于 1kb 的 RNA 用 1% 琼脂糖,小于 1kb 的 RNA 用 1.4% 琼脂糖. 将琼脂糖溶于 1X 甲基汞凝胶屯泳缓冲液,冷却至 55°C 后,加氢, 氧化甲基汞至终浓度为 5 mmol/L,随后灌胶。

      2) 电泳:将等体积的 2X 凝胶加样缓冲液与 RNA 溶液混勻,点样,电泳。

      3) 结果观察:电泳结束后,用含 0.4 g/ml 溴化乙锭的 0.lmol/L 乙酸铵溶液浸泡凝胶即 30〜45 min,进行 RNA 染色,在紫外灯下观察。铵离子使甲基汞转化为带电的非挥发性复合物,并促使溴化乙锭与 RNA 的结合。


注意事项

       1) 氢氧化甲基汞是剧毒品,且挥发性极强. 最好在通风橱中操作。

       2) 氢氧化甲基汞应加入凝胶中而不能加入到甲基汞凝胶电泳缓冲液中。这种化合物不带电荷,因此不能很快迁移出凝胶。然而如果电泳过程中将凝胶浸在电泳液中,则甲基汞离子会扩散至凝胶外。为避免这问题,可调整电泳缓冲液的液面,使之能与凝胶的各边保持完全接通,而不溅到凝胶表面。加样完毕且 RNA 进入凝胶后,用保鲜膜覆盖凝胶,以防止它在电泳过程中干涸。

此文转载:丁香通

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