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总RNA的提取

      完整RNA 的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即1):样品细胞或组织的有效破碎;2),有效地使核蛋白复合体变性;3),对内源RNA酶的有效抑制;4)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;5),对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径,1),提取总核酸,再用氯化锂将RNA 沉淀出来;2),直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失,目前该方法的使用频率已很低。


方法一:总RNA 的试剂盒快速提取

       一些公司推出的总RNA 提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA 中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

一:仪器

      恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽。

二:试剂

      R NA 提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇

操作步骤

(一):细胞或组织破碎

A:微生物材料

      1:发酵3-4天(或对数生长期)的菌体,离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)

      2:用经DEPC处理的水洗菌丝体2-3次,并尽量除去残存的水

      3:加液氮充分研磨,使其成为粉末,以释放RNA

      4:研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。

B:动植物细胞培养材料 (适用的样品量为细胞:108)

      1:细胞或组织培养:按常规方法进行

      2:深层悬浮培养细胞的破碎:

      (1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4℃,3000g离心5分钟

      (2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000g离心5分钟,

      (3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆

      3:表面培养细胞的破碎:

      (1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108

      (2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大。

      (3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次。

      (4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞。

C:植物组织破碎 (适用的样品量为0.05g组织)

      (1)将600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。

      (2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻

      (3)在液氮下,研磨组织块

      (4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

D:动物组织破碎 (适用的样品量为1克组织)

     (1)将12毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。

     (2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎。

     注1:研磨组织块用于RNA 提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。

     2:变性液及相应的离心管需预冷。

(二):RNA 的抽提

      在经变性液匀浆的细胞或组织600ul+60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。

      600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

      冰裕中10-15分钟,离心,4℃,10000g,20分钟。

     上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA。

      离心4℃,10000g,20分钟。

      沉淀RNA ,冷冻干燥15分钟 , RNA 沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解,可在65℃加热,但时间应极短)。

      60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。

      600ul酚\氯仿\异戊醇(25\24\1),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

      冰裕中10-15分钟,离心,4℃,10000g,20分钟。

      上层水相吸至无菌离心管中。

      等体积异丙醇二次沉淀(-70℃,30分钟),75%乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA 酶的水中(对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M,再加入2.5体积的乙醇,-70℃保存。)

      注:1变性液组成:25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇),65℃溶解,过滤灭菌,4℃预冷。

      2酸性酚配制:55℃时,500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠,混匀,静止分层后,去上清,再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。



方法二: 氯化锂法提取总RNA

      本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶,用氯化锂选择沉淀RNA ,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高,小RNA 片断丢失的缺陷。

      仪器: 同上

      试剂:

      氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,过滤灭菌】

      悬浮液【10mM  Tris-HCL (pH7.6) ,1mM  EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】

      其余同上

操作步骤:

       1:对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中

       2:匀桨液在0-4℃放置4小时后,12000g离心30分钟

       3:取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液,重复步骤2

       4:沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟

       5:取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心。

       6:70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

       7:RNA 溶解液溶解沉淀,得RNA ,分装,于-70℃保存。



方法三:蛋白酶-热酚法

      本方法适合于病毒RNA 的提取

      仪器: 同上

      试剂: 蛋白酶K(终浓度50μg/ml)

      2×缓冲液:1%SDS  20mMTris-HCL (pH 7.6)  0.2MnaCL

      其余同上

操作:

       1,提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟

       2,加入等体积65℃预热的酚溶液,轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。

       3,离心,取上清,氯仿抽提一次

       4,取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心(10000g,10min)。

       5,70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

       6,RNA 溶解液溶解沉淀,得RNA ,分装,于-70℃保存。

       上面介绍了一些核酸(DNA、RNA )提取方法,在进行具体实验时,应根据研究对象的性质,提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。以下一些原则和建议对核酸提取的操作可能会有一定的裨益。

       1:在核酸提取时,为了增加细胞的裂解度,增加核蛋白复合体破碎度,以释放更多的游离核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在确保没有核酸水解酶存在的前提下,酶反应时间越长越好。

       2:有时在使用蛋白酶时,为了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL,并且可将反应温度提高到50-60℃,并将反应时间缩短到15-25min,但酶用量必须提高10-20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA,因游离金属离子对酶有抑制。

       3:许多植物材料中富含酚,在细胞破碎时,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的锟类物资,影响核酸的提取及降低提取质量,在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体,在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

       4:许多生物材料在提取核酸时,都会遇到多糖的污染问题,具体表现为有机溶剂沉淀时,沉淀很多,但复溶时,大量沉淀不溶,电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法

      (1)CTAB多次抽提。

      (2)在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右),对低浓度样品再进行沉淀。

      (3)在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂,此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积,异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

      5:在核酸提取时,酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿,但酚与水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能损失部分核酸外,水相中还会残留酚,而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制,因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性,也可用单一酚作变性己,但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。

      6:在操作中当加入变性剂氯仿后,为了保证核酸样品的完整性,操作要轻,尤其在提DNA时,更要避免剧烈操作。

      7:在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

      8:在提取核酸时,如样品浓度低,则应增加有机溶剂沉淀时间,-70℃下>30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。

      9:在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高,而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中,因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存,低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

      10:核酸提取后可通过PCR 、RT-PCR直接扩增出目的基因片断,也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针,再用此探针从文库中筛选出完整基因。有关这些内容在下面各篇幅中会详细介绍。


此文转载:丁香通



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