细菌RNA制备实验

实验材料

      RNA


试剂、试剂盒

       STET   氯仿   乙酸钠   氯化铯   无水乙醇   EDTA


仪器、耗材

      离心机   分光光度计   摇床


实验步骤


      1.  培养100 ml 大肠杆菌或500 ml 蓝细菌至对数生长期,加入1/20体积终止缓冲液,置于冰上。
      2.  于4℃用JA-10转子17 700 g 离心5 min 收集细胞。
      3.  用2 ml STET裂解液重悬细胞,加入100 μl 0.2 mol/l 的VRC,移入15 ml 聚丙烯管子。
      4.  加入1 ml 缓冲液平衡酚,振荡1 min 再加1 ml 氯仿,振荡1 min,于4℃用JA-17转子10 000 g 离心10 min,收集水相。
      5.  加入1/10体积3 mol/l 乙酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇,于4℃ 10 000 g 离心10 min。
      6.  用2 ml 0.2 mol/l VRC溶液重溶沉淀。
      7.  用1:1酚/氯仿抽提2遍后,按步骤5重新沉淀。
      8.  如用TLA-100.3转子
      (1)重溶沉淀于2 ml DEPC处理水中,加1 g 固体CsCl并使之完全溶解。
      (2)取2.25 ml 加在13 mm ×51 mm TLA-100.3聚碳酸酯超离心管的0.75 ml CsCl垫层之上,于20℃ 280 000 g 离心1 h。
      9.  如用SW-41转子
      (1)重溶沉淀于6 ml DEPC处理水中,加入4.5 g 固体CsCl并使之完全溶解。
      (2)补加DEPC处理水至9 ml,并将其加在14 mm×89 mm Ultraclear超离心管的3 ml CsCl垫层之上,于20℃150 000 g 离心24 h。
      10.  用无菌巴斯德吸管小心地移去界面的DNA层,然后移去上层CsCl液,倾去残余液体,作一记号标记RNA沉淀的所在。
      11.  用纸巾擦干离心管壁,沉淀用0.36 ml DEPC处理水重溶并移至1.5 ml 的微量离心管中。
      12.  加入1/10体3 mol/l 乙酸钠和2.5倍体积冰冷无水乙醇,于-70℃沉淀20 min,于4 ℃用微量离心机高速离心5 min。
      13.  RNA沉淀加入1 ml 冰冷70%乙醇,再于4℃用微量离心机高速离心5 min。
      14.  晾干沉淀,并溶解于200 μl DEPC处理过的水,测A260和A280定量RNA。

      15.  最后调节浓度至4 μg/μl,于-70℃长期保存或以乙醇沉淀的形式保存。


此文转载:丁香通


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