2.细胞复苏

     （1）取一塑料杯盛上适量自来水浴锅加热至40℃左右，或直接使用37~38℃的水浴。从液氮中取出冻存管立即投入温水中迅速化冻。

      （2）取出冻存管，擦去表面的水，用75℃乙醇清洁管口，打开。

      （3）如果是添加DMS0的冻存液，则需要将DMSO去除。离心去上清收集细胞沉淀，加入无血清培养液洗一次，再次离心去上清。加入3mL含10%牛血清的新鲜培养基，于小培养瓶中培养。如果是添加甘油的冻存液，则不必去除，直接加入2mL含10%牛血清的新鲜培养基，吸入小培养瓶中培养。

      （4）吸取冻存管中剩余的生冻存原液27μL至一次性PE手套上再加入3μL台盼蓝染液，混匀。滴加在细胞计数板上。显微镜下计数细胞，以检查复苏细胞的存活率。活细胞不被台盼蓝染液着色，仍是透明的白色；死细胞的细胞膜破损，台盼蓝进入细胞，细胞呈蓝色。计算其百分比，得到细胞存活率。

      （5）每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满可进行传代培养。

【注意事项】

      （1）在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃冰箱中。

      （2）准确记录细胞的种类、冻存的时间、冻存液的品种和冻存者的姓名。

      （3）细胞冻存和复苏的操作容易造成污染，需特别注意无菌操作。

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