2.原代培养操作

（1）取怀孕14~20d的母鼠，断颈处死，固定在解剖台上，用2%碘酒和75%酒精棉球消毒腹部皮肤。无菌条件下，用大手术剪将皮毛层从胸骨柄下部剪到耻骨联合。换用小直剪剪开腹肌，剖开腹腔，暴露子宫。

（2）用镊子将子宫提起，眼科剪依次剪断子宫系膜，分离出子宫。剪断子宫角，取出整个子宫，在无菌滤纸上吸干血迹。置于盛有Hanks的培养皿内。用Hanks洗涤子宫表面，弃除表面残余血迹。

（3）纵向剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有Hanks的培养皿内，充分洗涤，弃除表面的血迹。剪开胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜。用Hanks洗涤3次。

（4）剪去胚胎头部、四肢、除去内脏。将躯干部置于另一盛有Hanks液的培养皿内。用Hanks洗涤3次，匆留任何血迹。

（5）用弯头剪把胚胎躯干尽量剪碎，每个组织块小于1mm³大小。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用Hanks液洗涤2或3次，清洗后使组织块自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按两种方法进行。即消化法和组织块培养法。

（6）若使用消化法，则将组织块放入一无菌三角瓶内。三角瓶内预置一个磁力搅棒。加入10~30mL的0.125%的胰蛋白酶。37℃磁棒搅拌消化20min以上。加入少量血清终止消化过程。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，800r/min离心5~10min收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。

（7）若进行组织块培养，则不做步骤（6），加入几滴血清于组织块中，再用弯头吸管将组织块悬液吸起。在一小方瓶中逐个铺展开，注意将瓶底涂抹均匀。将瓶子翻转倒置后在37℃培养箱内放置2~3h。待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入4~5mL培养基，使细胞接触到培养液。放培养箱内继续进行培养。

【注意事项】

      （1）原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。

      （2）要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术、

      （3）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。

      （4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。

      （5）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。

      （6）原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。

      （7）本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞培养的成功率。

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