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蛋白质检测(六)

蛋白印迹法

五 抗原-抗体反应

1 仪器和设备

塑料盒、振荡器。

2 封闭

一般采用5%脱脂奶粉进行封闭,室温,30-60min

*封闭液的浓度可以是(1%-5%),根据自己的条件摸索浓度就可以。

封闭液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。

3 一抗的处理

(1)一抗稀释倍数:根据样本和抗体的种类不同,预实验寻找选择最适稀释倍数。

(2)一抗孵育时间:一抗的孵育时间是从几个小时到过夜不等,建议使用较高较高的稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。一抗过高会产生非特异性条带。

(3)一抗孵育时间:尽可能低温孵育,特别是磷酸化一抗过夜时应在4℃进行,否则会产生污染而破坏磷酸化蛋白。

*孵育一抗最好在摇床上进行,防止结合不均匀。

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