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【动物实验】-CRISPR/Cas9介导人HBB基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入

目的 将人地贫相关基因 HBB(hHBB)的高频突变体基因型 Condons41/42(-CTTT)靶向敲入猪成纤维细胞,并筛选出基因型阳性的纯合子细胞系。

方法(1)合成人地贫相关基因 HBB(hHBB)突变体,并构建猪 HBB 位点两条同源臂载体。(2)利用 infusion 技术将 hHBB 突变体插入两个同源臂之间,构建同源重组终载体。(3)用在线软件htp∶//erispr.mit.edu/设计靶向猪 HB 的 sgRNA,并在猪 PK15 细胞中验证其活性。(4)利用电转染法把 CRISPR/Cas9、sgRNA 和目的载体共同转入巴马猪胎儿成纤维细胞中,筛选单细胞克隆。

结果(1)合成了 hHBB 突变体,从野生型巴马猪基因组上扩增左同源臂(1.062 × 10³)以及右同源臂(1.024× 10'),并将三者连接到终载体 pGH-LA-hHBB-RA。(2)设计合成了11 条靶向猪 HBB 基因的 sgRNA,全部验证活性后最终挑选#2sgRNA和#11sgRNA 用于后续实验。(3)通过 CRISPR 系统共制备出15 株有hHBB 突变体定点敲入的猪成纤维细胞系,其中6 株细胞正常表达 hMHBB 基因。

结论 本研究所制备的携带人源化 HBB 基因突变体的猪成纤维细胞,将为创制高度模拟人地贫的模型猪奠定基础。

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