我要啦免费统计
当前位置 :主页 > 实验服务 > 蛋白组学 >
单克隆实验技巧

        当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力,各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测,细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。


一. 实验材料及试剂

       水浴锅、超净台、倒置显微镜、酒精灯、移液枪等;Argrose、BIOWEST  REGULAR Argrose G10、双蒸水(DDW)、血清、双抗、吉姆萨染液、胰蛋白酶、R1640、PBS等。


二、实验内容

 软琼脂克隆形成实验——悬浮细胞

      1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7% Argrose,Argrose用DNA电泳用BIOWEST  REGULAR Argrose G10(4℃),溶剂用双蒸水(DDW),高压灭菌后,维持在42℃中不会凝固;


      2、实验前,将水浴锅放入超净台内,紫外照射,设定温度42℃。提前融化血清和双抗。


      3、如已制好上下胶,则在微波炉中溶解1.2% Argrose下胶和0.7% Argrose上胶,降温后放入42℃水浴锅中保持。


      4、根据实验需要的量配制20% FBS+2×R1640(5种细胞配40ml),每种细胞设3 个复孔。


      5、铺下胶:按1:1比例使1.2% Argrose下胶和20%FBS+2×R1640混合,6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液,轻轻混匀,室温静置待下胶凝固(加混合液时不能产生气泡)。对于一个6孔盘,配5ml上述培养液+5ml 1.2% Argrose下胶于50ml离心管中(离心管要一直置于水浴锅中)。


       6、细胞计数:取各组对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用正常培养液调整细胞密度至40×104/ml以上,这样加的体积小于100ul,不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞,准备4个孔的细胞数,即4×104。


        7、铺上胶:按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×R1640,每种细胞需先配2ml(20%FBS+2×R1640)+2ml 0.7% Argrose上胶于离心管中混匀,放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中,混匀后迅速加入6孔板中,每孔1ml。待上层琼脂凝固后,置于5%CO2,37℃,培养2-3 周。


       8、间隔2天补加200ul 10%FBS+R1640,以防过于干燥。


        9、计数克隆:把平皿放置在倒置显微镜下(100×),在镜下随机选择10个视野,计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数,克隆形成率=大于50个克隆数/所有克隆数×100%。每孔加入1ml的吉姆萨染液,20min,镜下拍照。

      

想了解更多相关信息,请关注: http://www.chinazglab.com/
   咨询更多实验情况可以联系晏老师,联系电话:15870661478 (微信同号)




上一篇:ChIP染色质免疫沉淀技术
下一篇:蛋白质检测
分享到: