构建多基因敲除动物模型
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-02-28
前期研究发现，一个內源多肽的受体家族由A,B,C三个基因组成，在小鼠17号染色体间隔排列形成一个大约跨度为95kb的基因簇。采用ES细胞打靶的方法构建打靶载体、筛选ES细胞等，这种方法曾获诺贝尔奖。
实验伊始，构建敲除小鼠可是大工程，至少耗时2年左右，从构建受体A基因打靶载体开始，采用通常的3Kb+2Kb同源臂的测量，将二号外显子替换成为筛选标记基因。大家知道，基因组DNA做PCR并不容易，也是换了N对引物才克隆出两条同源臂，前后折腾了4个月，总算构建好了打靶载体。
接下来是ES细胞筛选，这一步很关键，过程充满艰辛。ES细胞看似好养，但稍不留神就会分化失去部分胚胎干细胞性，导致其不能发育成为生殖细胞，无法将突变传递到子代。如果没有germline transmission，前面所有的工作等于零。好不容易单克隆筛选成功，PCR又碰了壁。现在一般都采用长片段PCR的方法来筛选克隆，比以前需要同位素做southern杂交轻松了很多。但是，两条引物一条需要设计在筛选标记基因上，另外一条需要设计在同源臂以外的小鼠基因组上，产物长度都超过3kb，没有阳性对照，无法确认是引物设计有问题还是根本没有阳性克隆。PCR做不出来，筛选的克隆又不忍心随便扔掉，引物换了无数。
CRISPR/Cas9 是一种高效，低毒且准确靶向的新型转基因系统。CRISPR是从细菌用来抵御病毒侵袭的一种获得性免疫防御机制中开发出来的。利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰。操作简便，周期短。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑。一般五周左右就能够得到F0的首建鼠（founder），具体工作流程：
实验伊始，构建敲除小鼠可是大工程，至少耗时2年左右，从构建受体A基因打靶载体开始，采用通常的3Kb+2Kb同源臂的测量，将二号外显子替换成为筛选标记基因。大家知道，基因组DNA做PCR并不容易，也是换了N对引物才克隆出两条同源臂，前后折腾了4个月，总算构建好了打靶载体。
接下来是ES细胞筛选，这一步很关键，过程充满艰辛。ES细胞看似好养，但稍不留神就会分化失去部分胚胎干细胞性，导致其不能发育成为生殖细胞，无法将突变传递到子代。如果没有germline transmission，前面所有的工作等于零。好不容易单克隆筛选成功，PCR又碰了壁。现在一般都采用长片段PCR的方法来筛选克隆，比以前需要同位素做southern杂交轻松了很多。但是，两条引物一条需要设计在筛选标记基因上，另外一条需要设计在同源臂以外的小鼠基因组上，产物长度都超过3kb，没有阳性对照，无法确认是引物设计有问题还是根本没有阳性克隆。PCR做不出来，筛选的克隆又不忍心随便扔掉，引物换了无数。
CRISPR/Cas9 是一种高效，低毒且准确靶向的新型转基因系统。CRISPR是从细菌用来抵御病毒侵袭的一种获得性免疫防御机制中开发出来的。利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰。操作简便，周期短。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑。一般五周左右就能够得到F0的首建鼠（founder），具体工作流程：
A，B，C三个基因都是一个多肽的受体，基因之间会不会有redundancy？这个问题我们在细胞水平的研究论文投稿时就被问到，我们也证明从信号通路上来看确实三个基因功能是重叠的。通过序列分析，发现这三个受体基因的物理位置靠得非常近，由于基因连锁的原因，在这么近的情况下，几乎没可能将这三个基因单独敲除的小鼠，通过杂交的方式获得三个基因同时敲除的小鼠。如果这三个基因功能有redundancy，那么单独敲除其中一个可能无法看到表型。假如单独敲除这三个基因都没有表型，那岂不是前功尽弃？
给出一个看起来可行的方案：Cas9在两个位点切开形成双链断裂之后，细胞会启动NHEJ的修复方式将断裂的双链DNA连接起来，这样会有一定概率删除两个靶点之间的序列。这个小鼠虽然跨度为95Kb，但设计2个sgRNA，将中间片段整基因组删除应该是可以成功的。
经过2个月的等待，：95Kb的片段成功的在F0代小鼠里面删除了，而且同时得到了2只founder。
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