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免疫铁蛋白电镜技术

1.基本原理
铁蛋白的分子量460kD,为一种含铁(约占23%)的蛋白质。直径10―12nm。目前常用的间接免疫染色技术是应用低分子量的双功能试剂将第二抗体与铁蛋白相连,制备标记抗体。此复合物既保留了抗体的免疫活性,又因铁蛋白含有2000―3000个铁原子的致密铁离子核心,形成四个圆形致密区,所以,具有较高的电子密度,易于电镜观察。
早年的研究中,因没有铁蛋白标记抗体商品出售,所以多数实验室需要自己制备铁蛋白,再标记抗体,操作较麻烦,且质量控制难度也较大,难以广泛应用。目前已有铁蛋白标记的多种间接抗体(第二抗体)商品出售。
2.电镜标本的制备方法
1. 固定:与电镜酶细胞化学相似,可用醛类和OsO4双重固定,以保存组织细胞的超微结构。有文献记载,4%多聚甲醛/0.5%戊二醛(pH7.2)4℃固定,继之0.2%OsO4 后固定,并不影响抗原活性,但笔者认为应尽量避免或缩短OsO4 后固定时间为宜。
铁蛋白标记的抗体分子量较大,较适合于细胞表面抗原的定位研究,而对细胞内抗原的  研究则需进行适当处理,以增强其标记抗体的通透性。常用方法如下:
    ① 冻融法:小块组织或细胞固定后,可用液氮速冻、室温迅速融化,使细胞膜破裂,有利于标记抗体进入细胞内与其相应抗原结合,但超微结构的保存不甚理想。
    ② 冰冻切片法:固定的组织经5%蔗糖脱水,液氮速冻,制作10―15gm厚的冰冻切片,PBS漂洗,直接进行包埋前免疫染色,再按常规电镜样品处理。
2. 免疫染色:多用包埋前染色。以间接染色法使用居多,孵育均在湿盒内进行,一般操作程序如下:
     ① 将组织标本制成10~15um冰冻切片;
     ② 切片漂洗后,1%BSA孵育,室温15分钟;
     ③ 特异性抗体(第一抗体)中室温孵育30~60分钟,也可4℃孵育过夜;
     ④ 冷PBS充分漂洗3次,每次3~5分钟;
     ⑤ 铁蛋白标记的第二抗体孵育,室温30~45分钟;
     ⑥ 漂洗同上,再经戊二醛固定1小时;
     ⑦ 漂洗后,1%OsO4 固定15~30分钟;

⑧ 样品的脱水、包埋、超薄切片制作及电镜观察等处理与常规电镜相同。

 

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