主要试剂配制

  1、1xPBS 缓冲液：秤取 NaCl 8.0g, KCl 0.2 g, Na2HPO4- 12H2O 2.85 g,KH2PO4 0.24 g, 加双蒸水900ml溶解,调pH值至7.4,量筒定容至IL，高温高压灭菌后使用。

  2、0.5%Triton X-100：取50ul Triton X-100加入10mlPBS中，然后放入37℃水浴锅溶解。

  3、a柠檬酸盐储存液的配制:0.1 MA每升含柠檬酸21 g;0.1 M梓檬酸钠缓冲液B:每升含梓檬酸钠29.4 g。b梓檬酸盐工作液的配制：0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)：每升含A液19 mL、B液81 mL,加蒸馏水溶解,调pH值至6.0,量筒滴定至1L。 

实验方法

  1.石蜡切片预处理准备

  烤片:组织切片入放入65℃-75℃烤箱中烤1.5h；

  脱蜡:切片在二甲苯放置10min更换二甲苯在放置10min；

  水化:将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇和80%乙醇中、纯化水各5min。

 

  2.切片抗原修复：将切片放入修复盒中加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，两分离开热源自然冷却。弃去抗原修复液,将切片用PBS淋洗。

 

  3.切片的打孔:0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min。

  4.消除内源性过氧化物酶：将切片移入湿盒中加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗；

  5.非特异性封闭：封闭PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

  5.免疫反应：

  一抗：水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（DDIT3 1：300，，GRP78 1：300、CASP121：200），放入湿盒，4℃孵育过夜。

  滴加兔/鼠二抗工作液，室温孵育1h，PBS充分淋洗；

  6.显色复染

  DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗1分钟 ；

  苏木精复染3分钟，盐酸酒精分化,反蓝；

  自来水冲洗1分钟 脱水、透明、封片、镜检。

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