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实验专栏丨细胞污染了,诺贝尔奖飞走了,怎么办?

你是不是,曾因为细胞污染影响实验进度而郁闷?


你有没有,实验顺利paper指日可待的关键时刻,细胞忽然污染了?


你是否还记得,河北科技大学韩春雨开创的NgAgo基因编辑技术因为细胞污染竟然重复不出来了?


今天我们就来备战:是不是细胞污染?是哪种细胞污染?如何识别?


一、  细胞污染的识别与解决办法

问题

如何识别

建议解决方法





细菌

 

细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。

1)可在培养液中加相应的抗生素处理;2)可以用四环素,庆大霉素,或者链霉素,前两者的工作浓度是50 μg/mL;链霉素的工作浓度是100 μg/mL。3)一旦发生污染,如果细胞不是特别特别珍贵,建议扔了。

 

霉菌

培养液中慢慢地出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,如同风中柳絮。细胞仍可生长,但时间一长,细胞的活力状态变差。

细胞一旦被霉菌污染,很难挽救。用硫酸铜溶液擦拭 CO2 孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体, 可以防止霉菌污染。


支原体

支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。培养液一般会浑浊。

①用MRA处理,每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康,效果好;②用清洗纯化法清除支原体污染的方法;③药物辅助加温处理;④使用支原体特异性血清

黑胶虫

低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液不浑。

一般不会太影响,细胞还是可以用的,如果太多了,可能会影响实验结果,可增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率。

真菌污染

一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,镜下有时候象丝状,有时候象珊瑚状。慢慢地会长出很细的黑色丝状物。

真菌生长的比较慢,不容易被发现,一旦发现也很难救活了,建议扔了,然后彻底消毒灭菌培养间。

原虫污染

培养液轻微浑浊,细小的点状物多,轻微活动,细胞繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。

配液消毒问题、操作问题、环境问题等等都可能。需去测试取培养基至培养瓶中(不加细胞),37 度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。


二、  细胞污染的预防


预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手:

1、添加抗生素


2、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。


3、从操作者做起

(1)进无菌室前要用肥皂洗手,按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。


(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。


(3)操作时要常更换吸管,一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。


4、防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分。


在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。细胞一旦购置或从别处引入,均应及早留种冻存,一旦发生污染可重新复苏培养。


5、无菌室的彻底消毒

1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;

2)甲醛熏蒸法:甲醛是一种广谱灭菌剂菌,其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。

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