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颜宁丨70天里第3篇Science!女神又来搞事情!

       当地时间2018年9月6日,颜宁研究组在《科学》(Science)在线发表了题为《人源电压门控钠离子通道Nav1.4与β1复合物的结构》(Structure of the human voltage-gated sodium channel Nav1.4 in complex with β1)的研究长文,揭示了首个人源电压门控钠离子通道(下简称钠通道)Nav1.4与它的特异性调节亚基β1复合物的冷冻电镜结构,分辨率高达3.2 埃(即0.32纳米),为深入理解其作用机制及疾病相关突变的机理提供了可靠模板。【公众号后台对话框输入“颜宁”可获取本次发表论文及以下6篇相关论文】



钠通道的“长跑历程”


       1945年,英国科学家霍奇金(Hodgkin)和赫胥黎(Huxley)第一次在枪乌贼的巨大神经元上检测电流并首次记录到静息电位和动作电位;


       1952年,他们发现了电压门控的钠电流,开启了现代生物体内电信号研究的新纪元。钠通道负责动作电位的发生和传播,是所有神经元和肌肉细胞上电信号的基础。霍奇金和赫胥黎的发现为他们赢得了1963年的诺贝尔生理与医学奖。


       70年代,内尔(Neher)和索克曼(Sakmann)开始用膜片钳技术记录单个离子通道的电流,内尔于1980年首次记录到单个钠通道的电流。他们因此获得了1991年的诺贝尔生理与医学奖。1984年,日本科学家沼田秀作(Shosaku Numa)等人第一次克隆出电鳗中的钠通道的基因。几十年来,包括海利(Hille)、阿姆斯特朗(Armstrong)、波泽尼拉(Bezanilla)、卡特罗(Catteral)等在内的著名科学家极大推动了钠通道的生物物理和电生理研究。


       钠通道是由负责感受电压和离子选择的α亚基以及1-2个调节它的β亚基组成的。在人体中,α亚基有9种不同的亚型,分别被命名为Nav1.1-1.9,β亚基有4种亚型,分别被命名为β1-β4。α亚基一般包含大约2000个氨基酸,其中包含了四个序列相近结构类似的跨膜结构域I-IV,每个结构域含有6根跨膜螺旋。每个结构域中的前四根跨膜螺旋S1-S4构成电压感受器(VSD),而四组S5-S6跨膜螺旋共同构成位于整个结构中央的负责离子通透的孔道结构域,连接跨膜螺旋S5-S6之间的两个半穿膜短螺旋共同支撑一小段伸展序列,构成负责实现离子通透特异性的选择筛。连接第三和第四个结构域之间的序列比较短,已被证明对于钠通道的快速失活至关重要,但具体机理并不清楚。快速失活机制可以让钠通道在感受刺激,引起动作电位后迅速关闭,防止神经肌肉细胞持续性放电。同时钠钾泵重建膜电势,为下一次动作电位做好准备。因此钠通道的快速失活对它发挥正常的生理功能至关重要。


       钠通道的9种亚型具有组织分布特异性,它们的异常失活或者激活与多种严重的神经、心血管、和肌肉系统的疾病相关,例如Nav1.1和Nav1.5各自有400多种点突变分别与癫痫和心律失常相关,Nav1.4的异常会导致肌肉僵直或高钾血型周期性瘫痪,Nav1.7或Nav1.8的异常会造成痛觉丧失或者疼痛异常等。因此,钠通道是重要的制药靶点,是许多国际著名制药公司的重点研究对象。此外,钠通道是包括蛇毒、蝎毒、河豚毒素、蜘蛛毒素等在内的多种动物毒素的直接作用靶点。经过70多年的研究,关于人源钠通道的工作机理的电生理学研究已经铺天盖地,但因为获取哪怕微量的优质样品都极端困难,所以人源钠通道是结构生物学的最富挑战性的蛋白之一



颜宁的10余年钠通道研究


       颜宁自2007年独立领导实验室以来,就致力于钠通道的结构生物学研究,于2012年报道了一类海洋菌中的钠通道NavRh的晶体结构 (1)。但是细菌与真核生物的钠通道具有最基本的若干区别,比如具有不同的离子选择性,缺少快速失活机制,无法被毒素识别等等,因此不能成为研究真核钠通道的替代蛋白。所以,颜宁过去五年一直集中力量攻坚真核钠通道的结构与机理,终于在2017年首次报道了第一个真核钠通道的原子模型,是来自美国蟑螂中命名为NavPaS的3.8埃分辨率电镜结构 (2),几个月后又报道了在钠通道研究史中占据重要地位的来自电鳗的钠通道EeNav1.4的电镜结构 (3),并在该结构中首次看到钠通道的α亚基与β亚基之间的相互作用。尽管这两个结构代表了钠通道结构与机理研究的巨大飞跃,但是这两个通道都无法在外源表达系统中进行功能研究,从而限制它们成为模式研究蛋白。


图1. 人源Nav通道Nav1.4-β1的三维结构


       (A)人源Nav通道Nav1.4-β1的跨膜区和胞外区结构得到很好的解析;

       (B)从胞外侧看Nav1.4-β1有大面积的负电区域;

       (C)Nav1.4-β1的中央孔道从胞内侧看是开放状态;

       (D)计算Nav1.4-β1的中央孔道的半径。


       历经数年,在本次发表的文章研究中,研究人员们使用冷冻电镜技术,报道了人类Nav1.4-β1复合体的结构,分辨率达3.2 Å。具体来看,该结构提供了关于孔道结构域、电压感应域、以及β1亚基的详细信息,让我们了解了人类Nav1.4通道在钠离子渗透性上的分子基础,也为其四个跨膜重复区域的动力学不对称性提供了新的洞见。


       结构分析也进一步揭示了一些致病突变的作用机理。原来,如果影响到关键氨基酸,就会导致一种变构抑制效应,快速让Nav通道失活。这个人类Nav结构的阐明,不但解释了过去的一些发现,还铺平了通往未来研究的道路,使得针对Nav通道开发新药成为了可能。


       颜宁教授为学术经纬的读者们介绍了该研究的重要性:“Nav1.4几乎是所有钠通道中功能研究最全面、生物物理数据最多的一个亚型,但电鳗的Nav1.4通道无法在非内源体系中做电生理分析,所以没有办法进行深一步的研究。人类Nav1.4通道结构的获得改变了这一现状。今后科学家们能够以电生理数据为指导,获取Nav在不同状态下的结构,将静态的不同画面拼成‘动态电影’,最终能够呈现它工作的完整过程。”


       “另一方面,Nav通道是重要的制药靶点,Nav1.7与Nav1.8更是很多公司开发新型止痛剂的靶标。一直以来,很多人想获得Nav的抗体,但是因为没有办法拿到纯化的蛋白,所以连抗体都没法生成。我们这个工作的另外一重意义,就是说钠通道也是可以体外表达,完整折叠的。这样一个技术难关也被我们攻克了。”颜宁教授补充道。


研究成功的背后


       回首过去十多年,颜宁在清华大学领导的研究组陆续解析了原核电压门控钠离子通道NavRh的结构 (1),首个高分辨率的电压门控钙离子通道复合物Cav1.1的结构 (4, 5),首个真核钠通道NavPaS的结构 (2),首个钠通道与调控亚基的复合物结构 (3),首个动物毒素与钠通道复合物的结构 (6),终于获得首个人源钠通道的结构。因为Nav1.4具有确定的生理功能,在此之前已经通过生物物理、电生理等各种手段在多个表达系统中广泛研究,如今其精确结构的解析翻开了钠通道结构与机理研究新的一页,向完整阐释钠通道的工作过程迈出最重要的一步。


目前公认颜宁最美照片,没有之一


       原清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心颜宁教授是该篇研究论文的通讯作者。


       清华大学医学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者潘孝敬、CLS三年级博士生李张强、医学院副研究员周强、医学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者申怀宗和药学院肖百龙实验室博士生吴坤为共同第一作者。国家蛋白质科学中心(北京)清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为该研究的数据收集和数据处理提供了支持,清华大学冷冻电镜平台的雷建林博士对数据收集进行了指导,并获得工作人员李晓敏的技术辅助。清华大学熊巍实验室龚海鹏实验室对于电生理和分子动态模拟提供了指导和帮助。北京市结构生物学高精尖创新中心(清华)、生命科学联合中心(清华大学)、生物膜与膜生物工程国家重点实验室、科技部和基金委为该研究提供了经费支持。颜宁教授自2017年秋季入职普林斯顿大学分子生物学系后受到Shirley M. Tilghman讲席教授专项启动经费的支持。


相关论文

       1. X. Zhang et al., Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel. Nature 486, 130 (2012).

       2. H. Shen et al., Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution. Science 355,  (2017).

       3. Z. Yan et al., Structure of the Nav1.4-beta1 Complex from Electric Eel. Cell 170, 470 (2017).

       4. J. Wu et al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 complex. Science (New York, N.Y 350, aad2395 (2015).

       5. J. Wu et al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 A resolution. Nature 537, 191 (2016).

       6. H. Shen et al., Structural basis for the modulation of voltage-gated sodium channels by animal toxins. Science (New York, N.Y,  (2018).

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