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涨知识!你不知道的WB问答!

       蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。


原理如下图:



       但是该技术却非常依赖经验的积累,为了给广大实验同仁们提供有意义的参考和经验,小编将提供解决实验过程中遇到问题的一些办法,仅供参考。


 电泳转印不成功?


1、转印时间过短


2、电源条件不适当

       转印开始前核实电流;更换缓冲液或增加电压设定值;尝试高电场强度转印;核实电源最高的电流值。


3、蛋白转印穿透印迹膜

       如果印迹膜功率条件设定太高或转印时间过长,蛋白会穿过膜并转印到滤纸上。


4、蛋白转印方向相反

       凝胶/印迹膜三明治结构组装顺序相反或放入相反的电极板间;核实电源线的电极是否接反。


5、检测系统失灵或灵敏度太低

       加入适当的阴、阳性抗原对照试剂以检测试剂盒的灵敏度。


6、错误的电荷质量比

       使用更酸或更碱性的缓冲液增加转印效率;蛋白在它们的等电点附近不能全部转印(缓冲液的PH值应该比靶蛋白的等电点低或高2个PH值)


7、蛋白在凝胶中沉淀

       在缓冲液加入少量的SDS;消除或降低转印缓冲液中乙醇的含量


8、缓冲液中的甲醇抑制蛋白洗脱

       降低甲醇的含量,通常使用量为20%


9、电源线路故障或电源使用不当

       检查保险丝,检查电源输出功率


10、凝胶浓度过高

       降低%T(全单体)或%C(交联体)。使用5%C(甲叉丙烯酰胺交联剂),可使凝胶孔径最小。降低凝胶孔径最小。降低凝胶浓度,增大孔径,可以提高转印效率



蛋白印记免疫检测出现高背景



1、封闭不完全


2、清洗不充分

       增加清洗次数、时间以及清洗剂的去污力。

       在抗体缓冲液中加入Tween-20会降低非特异结合。


3、印迹膜在底物溶液中放置时间过长


4、电泳或转印过程中污染


5、凝胶上的蛋白样品过载或在转印缓冲液中使用了过多的SDS,蛋白直接穿透印迹膜并在转印体系中循环而不能结合在印迹膜上


6、一级或二级抗体浓度过高


7、温育槽被污染

清洗温育槽或使用一次性温育槽



中洪WB实验流程:


       ①做胶:先制成分离胶和压缩胶。

       ②上样:先做好制胶器平板,先后加入已制成的分离胶和压缩胶(需要大概十几分钟反应十几,与温度相关,成反比),之后加梳子(有孔,方便后期加入蛋白)加入蛋白。

       ③跑电泳:需要三个小时。

       ④转膜:把PVDF膜贴在胶上。

       ⑤封闭:封闭不需要的蛋白。

       ⑥一抗孵育:用的抗体是特定的,放在摇床上,时间需要一上午。

       ⑦洗膜:把多余的抗体洗掉,洗三次,每次十分钟。

       ⑧二抗孵育:抗体是通用的,只要来源相同即可。

       ⑨再次洗膜:把多余的抗体洗掉,洗三次,每次十分钟。

       ⑩曝光:放在成像仪上面成像。(条带清晰,直,无气泡,结果就是好的)


中洪WB实验操作与结果案例图




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