影响限制性内切酶反应的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数、增大反应体枳以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。

单酶单DNA样品消化

实验方法原理       

进行限制酶切割反应只需简单地将酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液温育，其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。

实验材料     

DNA

试剂、试剂盒      

TE酶切缓冲液EDTA

仪器、耗材  

电泳仪

实验步骤     

1.  混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中

（1）x μl  DNA

（2）2 μl  10×酶切缓冲液

（3）18-x μl  H2O

（4）20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。

（5）只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可增减待切割DNA的量和反应条件。

2.  加入限制性内切酶（1~5 U/μg DNA）在推荐的温度温育1 h （—般是37℃）。

3.  理论上，1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下，60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。

4.  酶的体积应低于反应总体积的1/10，因为酶液中的甘油可以干扰反应。

5.  加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.  反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（终浓度为12. 5 mol/l） 以螯合镁离于而终止。

7.  很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活，有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。

8.  如果酶对热具完全抗性，可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。

此文转载来源：丁香通