利用 ABIPRISMRigDye 末端化学法进行自动荧光测序是高效率 DN 八序列测定的方法之一。序列梯度是由标准的 Sanger 方法利用荧光标记链末端的核苷而产生的。

试剂、试剂盒         

乙醇洗脱上样液

仪器、耗材     

磁性分离装置平板夹平板架测序反应纯化系统

实验步骤

一、材料

 

1. 缓冲液、溶液和试剂

 

用于测序的胶洗脱/上样液 (见表 9-4)

 

90% 乙酵洗涤液

 

2. 特殊设备

 

MagnaBotⅡ磁性分离装置（Promega)

 

平板夹 96(Promega)

 

平板架（Promega)

 

3. 其他

 

WizardMagneSil 测序反应纯化系统（Promega; 包括 MagneSilGREEN[顺磁性顆粒])

 

96 孔板

二、方法

1. 将 96 孔板装到平板夹 96 中 [图 9-10(a)、（b)]。

 

2. 使用平板架 [图 9-10(c)] 将平板放置在自动机械工作台上。

 

3. 剧烈振荡瓶以重悬 MagneSil 顆粒，每 20ul 测序反应体系中加入 180ulMagneSil颗粒。

 

4. 室温下温育 5 min, 期间分别在 0、2.5 min 和 5 min 时进行抽吸混合。

 

5. 将板放到 MagnaBotⅡ磁性分离装置 [图 9-10(d)] 上以捕获颗粒。

 

6. 移弃液体，避免损失任何颗粒。

 

7. 从 MagnaBotⅡ设备上取出板，置于平板架上。

 

8. 每个样品中加入 100ul90% 的乙醇。

 

9. 室温下温育 5 min, 期间分别在 0、2.5 min 和 5 min 时进行抽吸混合。

 

10. 将板放到 MagnaBotnⅡ磁性分离装置上以捕获颗粒。

 

11. 移弃液体，避免损失任何顆粒。

 

12. 重复步骤 7~11 使总洗涤次数达到 2 次。

 

13. 顆粒在室温下风干约 10 min。

 

14. 加适量洗脱/上样液（表 9-4)。

 

15. 室温下温育 1~2 min。

16. 将板放到 MagnaBotnⅡ磁性分离装置上以捕获顆粒。

 

17. 将已纯化的测序反应体系转移到干净的 96 孔板，小心以避免损失任何顆粒。

此文转载来源：丁香通