RNA的Nouthern印迹和狭线杂交分析实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-09
Northern blot 是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中某一特异 mRNA 的表达丰度，根据其迁移位置也可以判断基因表达转录物的大小。该技术应用十分广泛，常用于分析 RNA 样品中特定 mRNA 的
大小和丰度，也可用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异等研究。
实验材料
试剂、试剂盒
DEPC MOPS 甲醛 琼脂糖 乙酸铵 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸钠 溴化乙锭 SDS
仪器、耗材
实验步骤
1. 用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖，在水浴中冷至60℃时，移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。
2. 铺制凝胶使之凝固，拔去梳子，将凝胶放进电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。
3. 将每份样品的体积用水调整至11 μl，然后加入：
（1）5 μl 10×MOPS电泳缓冲液
（2）9 μl 12.3 mol/l 甲醛
（3）25 μl 甲酰胺
（4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保温15 min。
4. 加入10 μl 醛加样缓冲液，在旋涡混合器中振荡，并在微量离心机中稍加离心以回收液滴。
5. 每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10 μg RNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。
6. 在5 V/cm 电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。
7. 用溴化乙锭染色
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加 入足够量的0.5 mol/l 乙酸铵覆盖，浸泡20 min 换液再泡20 min 以除去甲醛。
（3）倾去液体，加入含0.5 μl /ml 溴化乙锭的0.5 mol/l 乙酸铵，染色40 min。
（4）必要时以0.5 mol/l 乙酸铵脱色1 h。
8. 用吖啶橙染色
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸钠中染色2 min。
（3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20 min。
9. 在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。
10. 将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿，加足够的去离子水浸洗几次以除去甲醛。
11. 凝胶浸泡在10倍体枳的0.05 mol/l NaOH/1.5 mol/l NaCl中30 min，使RNA部分水解。
12. 接着浸泡于10倍体积的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl缓冲液中和30 min。
13. 将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45 min。
来源：丁香通
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