一、原理与方法

 

PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

 

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。

 

二、仪器与试剂

 

（1）样品：

 

多酚氧化酶粗酶液

 

硫酸铵沉淀组分

 

DE-52洗脱组分

 

葡聚糖凝胶洗脱组分

 

（2）底物：

 

邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液

 

（3）反应体系：

 

0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8

 

（4）器皿与仪器：

 

试管、恒温水浴等

 

分光光度计

 

三、酶蛋白的比活性

 

比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质

 

四、实验结果与分析

 

1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

 

结果列表

 

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

 

空白 0 0 3 0.16 0.09

 

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

 

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

 

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

 

分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

 

2. DE-52的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

 

结果列表

 

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

 

空白 0 0 3 0.03 0.05

 

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

 

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

 

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

 

分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。