当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

（一）实验材料及试剂

水浴锅、超净台、倒置显微镜、酒精灯、移液枪等；Argrose、BIOWEST  REGULAR Argrose G10、双蒸水（DDW）、血清、双抗、吉姆萨染液、胰蛋白酶、R1640、PBS等。

（二）实验内容

          软琼脂克隆形成实验——悬浮细胞

         1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；

         2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。

         3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2% Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

         4、根据实验需要的量配制20% FBS+2×R1640（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。

         5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×R1640混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

         6、细胞计数：取各组对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×10⁴／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×10⁴。

         7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×R1640，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×R1640）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO₂，37℃，培养2-3 周。

         8、间隔2天补加200ul 10%FBS+R1640，以防过于干燥。

         9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数/所有克隆数×100%。每孔加入1ml的吉姆萨染液，20min，镜下拍照。

   平板克隆形成实验

         1、取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。

         2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃，5% CO₂及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。

         3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

         4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率= (克隆数/接种细胞数)×100%                

（三）注意事项

         1、平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

         2、琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装；

         3、细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；

         4、软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；

         5、接种时细胞密度适度，不可过高。

         6、细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。

         7、细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

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