质粒DNA提取
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-03-21
实验方法原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
实验材料 大肠杆菌
试剂、试剂盒 Tris-Hcl EDTA葡萄糖 NaOHKAacNaAc异丙醇溶菌酶酚:氯仿无水乙醇LB培养基
仪器、耗材 超净工作台培养箱摇床恒温水浴锅台式离心机取液器低温冰箱冷冻真空干燥机电泳仪水平电泳槽紫外观测仪
实验步骤
一、材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：
（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、操作步骤
1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。
2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。
3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。
8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14. 电泳检测提取DNA的质量。
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
实验材料 大肠杆菌
试剂、试剂盒 Tris-Hcl EDTA葡萄糖 NaOHKAacNaAc异丙醇溶菌酶酚:氯仿无水乙醇LB培养基
仪器、耗材 超净工作台培养箱摇床恒温水浴锅台式离心机取液器低温冰箱冷冻真空干燥机电泳仪水平电泳槽紫外观测仪
实验步骤
一、材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：
（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、操作步骤
1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。
2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。
3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。
8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14. 电泳检测提取DNA的质量。
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