凝胶迁移（EMSA）实验1
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-05-16
凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理
EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤
1、实验前准备
（1）合理的实验方案
根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备
根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物
（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：
蛋白样本（2-5μg） Xμl
poly d(I-C) 1μl
Binding Buffer 2μl
Nuclease-Free ddH2O Xμl
总体积 9μl
（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）
（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳
（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）
5XTBE 1ml
30%Acrylamide/Bis 2.2ml
deionized,sterilewater 6.62ml
80%Glycerol 80μl
10%AP 90μl
TEMED 10μl
总体积 10ml
（2）按标准步骤制备凝胶。
（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）
4、转膜
（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。
（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。
5、检测
（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）
（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。
（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）
（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。
（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
一、实验原理
EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤
1、实验前准备
（1）合理的实验方案
根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备
根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物
（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：
蛋白样本（2-5μg） Xμl
poly d(I-C) 1μl
Binding Buffer 2μl
Nuclease-Free ddH2O Xμl
总体积 9μl
（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）
（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳
（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）
5XTBE 1ml
30%Acrylamide/Bis 2.2ml
deionized,sterilewater 6.62ml
80%Glycerol 80μl
10%AP 90μl
TEMED 10μl
总体积 10ml
（2）按标准步骤制备凝胶。
（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）
4、转膜
（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。
（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。
5、检测
（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）
（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。
（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）
（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。
（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。（转帖）
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