FISH和PRINS技术3
发布人:管理员 浏览次数: 发布时间:2017-11-01
二、用引物介导的原位标记(PRINS)
是PCR和荧光原位杂交(FISH)的结合, PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列,在聚合酶的驱动下,带有标记的脱氧核苷酸(FITC-dUTP或半抗原-dUTP)和dATP、dCTP、dGTP的延伸,依赖标记,新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC,用荧光显微镜观察。
PRINS实验步骤
1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS;
2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min;
3. 蛋白酶K(25 μg/ml)消化37℃ 15 min;
4. 分别用80%,95%和100%酒精脱水,室温干片;
5. 加PCR混合液25 μL(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,各加200 μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl,引物250 ng,Taq DNA聚合酶2 U),加盖片;
6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min;
7. 用0.1×SSC液,65℃洗5 min;
8. 片于65℃ 10~20 s;用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min,2次;
9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min;
10. 加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2 h;
11. BufferⅢ液洗5 min;
12. 用BCIP-NBT显色1~2 h,在镜下控制,终止显色;
是PCR和荧光原位杂交(FISH)的结合, PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列,在聚合酶的驱动下,带有标记的脱氧核苷酸(FITC-dUTP或半抗原-dUTP)和dATP、dCTP、dGTP的延伸,依赖标记,新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC,用荧光显微镜观察。
PRINS实验步骤
1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS;
2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min;
3. 蛋白酶K(25 μg/ml)消化37℃ 15 min;
4. 分别用80%,95%和100%酒精脱水,室温干片;
5. 加PCR混合液25 μL(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,各加200 μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl,引物250 ng,Taq DNA聚合酶2 U),加盖片;
6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min;
7. 用0.1×SSC液,65℃洗5 min;
8. 片于65℃ 10~20 s;用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min,2次;
9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min;
10. 加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2 h;
11. BufferⅢ液洗5 min;
12. 用BCIP-NBT显色1~2 h,在镜下控制,终止显色;
13. 用中性红或核固红衬染,酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片。(转帖)
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