一些 RNA 转录物要求其 5＇末端有 m7 G(5＇)Ppp(5＇）G 帽子，它们在无细胞抽提物或在非洲爪蟾卵母细胞中才具有较高的翻译效率。也有报道表明具有甲基化帽子的转录物在体外剪切时具有较高的效率，并对核抽提物中的核酸酶具有更大的抗性

试剂、试剂盒     

    

DEPC处理的水 转录缓冲液 lOOmmol LDTT RNasin rATPrCTPrUTP rGTP0.5 mmol L m7 G(5＇)ppp(5＇)G DNA 模板 RNA 样品缓冲液 RNA 载样缓冲液 MOPS 缓冲液 TE 缓冲液

实验步骤      

  

一材料与设备

 

1)DEPC：处理的水

 

2) 转录缓冲液（5X):200 mmol/LTris-HCI(pH7.9),30 mmol/LMgCl2,lOmmol/L. 亚精胺，50 mmol/LNaCl

 

3)lOOmmol/LDTT

 

4)RNasin

 

5)rATP,rCTP，rUTP，各 2.5 mmol/L

 

6)rGTP0.5 mmol/L

 

7)m7 G(5＇)ppp(5＇)G,5 mmol/L

 

8)DNA 模板，1〜2 mg/ml

 

9)RNA 样品缓冲液：10 mmoL/I. 去离子甲酰胺，3.5 ml37% 甲醛，2 mlMOPS 缓冲

液

 

10)RNA 载样缓冲液:50% 甘油，lmmol/LEDTA，0.4% 溴酚蓝,lmg/ml 溴化乙锭

 

11)MOPS 缓冲液：0.2 mmol/LMOPS(pH7.0),50 mmol/L 乙酸钠,5 mmol/LEDTA(pH8.0)

12)TE 缓冲液

 

 

二操作方法

 

1) 体外转录生成 RNA

 

在无菌离心管中，室温下加入下述成分:

 

5X 转录缓冲液                                                4ul

 

100 mmol/LDTT                                              2ul

 

RNasin20U

 

rATP,rUTP,rCTP(各 2,5 mmol/L)                        4ul

 

GTP(O.5 mmol/L)                                            2ul

 

m7 G(5＇)ppp(5＇)G(5 mmol/L)                         2ul

 

DNA 模板 (1〜2 mg/ml)                                   1-2ug

 

加无核酸酶的水至终体积                                  19ul

 

2) 起始反应加入 1ul SP6、T7 或 T3RNA 聚合酶（15〜20U/ul)。

 

3)37〜40℃ 孵育 60 min。

 

4) 按 RNA 标准转录反应所述的方法除去 DNA 模板，纯化 RNA 转录物。

来源：丁香通