在 2 个 5'端的核苷酸进行核糖基 C2＇-甲氧基修饰。用修饰过的引物 PCR 扩增得到的 DNA 仍可降低 N+l 活性，由于 PCR 可以产生几个 kb 的长模板，因此可以制备少异质性的 RNA

实验材料         

8umol L 顶链 8umol L 底链5＇末端 2 个核苻酸进行甲氧基修饰

试剂、试剂盒         

20X 缓冲液 NTP 混合物 lmol LNaOH 聚乙二醇 8000 0.5mol LMgCl2 1mol L 谷氨酸钠 T7RNA 聚合酶 载样缓冲液

实验步骤

        

一材料与设备

 

1)8umol/L 顶链

 

2)8umol/L 底链，5＇末端 2 个核苻酸进行甲氧基修饰

 

3)20X 缓冲液:800 mmol/LNaCl.20 mmol/L 精胺，100 mmol/LDTT，0.2%TritonX-100(pH8.l)

 

4)NTP 混合物，各 80mol/L, 用 1mol/LNaOH 调 PH8.1

 

5)lmol/LNaOH。

 

6) 聚乙二醇 8000,400 mg/ml。

 

7)0.5mol/LMgCl2

 

8)1mol/L 谷氨酸钠 (pH8.l)

 

9)T7 RNA 聚合酶。

 

10) 载样缓冲液：8mol/L 尿素，lmmol/LEDTA，0,1% 一甲苯青 FF，0.1% 溴酚蓝

 

 

二、操作方法

1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质：

 

8umol/L 顶链 (终浓度 400nmol/L)                             1ul

 

8umol/L 底链（5＇端 2 个核苷                                 1ul

 

酸甲氧基修饰，终浓度 400nmol/L)

 

20X 缓冲液                                                              2ul

 

NTP 混合物                                                            2ul

 

聚乙二醇 8000                                                        5ul

 

0.5mol/LMgCl2                                                    1.12ul

 

1mol/L 谷氨酸钠                                                     1ul

 

T7RNA 聚合酶                                                        1ul

 

加无核酸酶的水至总体积为                                    20ul

 

2) 于 37℃ 反应 lh。

 

3) 加载样液，变件聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收，保存于一 20℃

注意事项        

1) 标准体系是 20ul 但每种成分可按比例放大体系，以增加转录物的量

 

2) 一般来说，NTP 的摩尔数与 Mg2+的庠尔数比例为 1:1.75, 但此比例可能需要优化。

 

3）对于某些模板，谷氨酸钠可以提尚转录产物的回收率。

来源：丁香通