目的 将携带人凝血因子IX(hFIX)基因(F9)的重组腺病毒转染C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞 (adipose-derived stem cell,ADSC),经过传代培养后,观察F9是否在ADSC中稳定表达,探索ADSC是否可作为血友病基因治疗的载体细胞。

方法 取C57BL/6小鼠腹股沟区脂肪,依据组织块悬浮法分离培养小鼠ADSC并进行传代培养,应用携带hFIX基因并含GFP荧光标记的重组腺病毒转染第3代ADSC,转染后再次进行传代培养至第 4、 5 代细胞。 荧光显微镜下观察细胞携带荧光数量,RT-PCR检测F9基因表达,ELISA法检测细胞上清液及Western Blot检测细胞内携带目的基因表达蛋白情况。

结果  (1)重组腺病毒转染后荧光显微镜下可见荧光表达,细胞传代后仍具有荧光。 (2)RT-PCR结果显示:四组 ADSC均可表达内参GAPDH基因片段,A、B、C组可检测到目的基因F9的表达,D组未检测到F9的表达。 (3) ELISA法检测凝血因子IX抗原( hFIX:Ag) 结果显示:A组(81.62±8.82)ng/mL、B组(52.50±3.25)ng/mL、C组(47.41±4.00)ng/mL明显高于D组检测值(0.76±0.44)ng/mL,差异具有显著性(P<0.05)。 (4)Western Blot法检测四组细胞内hFIX蛋白表达情况,结果显示A组蛋白表达灰度值(0.68±0.10)、B组(0.49±0.15)、C组(0.18±0.05)明显高于D组蛋白表达灰度值(0.02±0.01),差异具有显著性(P<0.05)。

结论 重组腺病毒转染ADSC后,经过传代后培养,仍可表达较高的hFIX活性,可以作为血友病基因治疗的载体细胞。