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外泌体的作用及其在口腔领域的研究展望

外泌体是一种区别于微泡具有特异脂质、蛋白、mRNAmiRNA的小的膜性囊泡结构。它大小均一,直径为40100nm,密度为1.101.18g/mL,最早是在20世纪80年代由Pan等在绵羊红细胞中发现。从被发现至今的近40年来,许多国内外学者对其进行了深入的基础研究和临床应用探讨。现对外泌体的来源与组成、提取与检测、作用及其与慢性炎症方面的关系加以综述。

 

1.外泌体的来源与组成

 

外泌体可由血小板、树突状细胞、淋巴细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等多种类型细胞主动分泌释放,在大多数体液中都能被检测到。与一般囊泡不同的是,外泌体不具有质膜而囊泡有质膜。

 

外泌体内主要含有:(1)胆固醇、鞘磷脂、脂筏等。(2)四跨膜蛋白、微管蛋白和肌动蛋白结合蛋白。除普遍含有以上3种蛋白外,外泌体可选择性地携带反映其生物起源和细胞来源的特异性蛋白,可反映原始细胞的生理状态和功能。(3)核酸物质,包括各种mRNAmiRNAsiRNA等。

 

2.外泌体的提取与检测

 

根据外泌体的物理特性(密度、大小和溶解度)和生物特性(表面抗原),常用的提取方法主要有4大类:(1)离心法,包括梯度离心、密度离心、旋转超滤等;(2)过滤法;(3)沉淀法;(4)免疫富集法。虽然可利用的选择很多,但这些方法处理样本耗时较长,含杂质蛋白较多,样本处理通量较低。目前仍没有一种方法能同时满足外泌体含量、纯度和生物活性的需求。不久前,宾夕法尼亚州立大学的研究人员绕过外泌体的物化特性,采用一种全新的策略——利用脂质分子探针去标记胞外囊泡,只需15min,分离效率和质量大大提高,堪比超高速离心方法,甚至优于后者。

 

根据外泌体的组成及结构,目前常用的鉴定手段如下。(1)形态观察:利用透射电镜观察常呈杯状,但在体液中常为球形;(2)免疫印迹分析及流式细胞仪鉴定特异性蛋白,包括AlixFlotillin-1Lamp-1Lamp-2CD63CD9HSP70等,其中HSP70CD63鉴定最多;(3)纳米颗粒追踪技术(nanoparticle tracking analysisNTA)可用于测量外泌体的大小(40100nm)和密度(1.101.18g/mL)。

 

3.外泌体的作用

 

目前的研究表明,外泌体具有多种生物学功能,包括去除细胞生长过程中的废弃蛋白、信号传导、提呈抗原激活T细胞以及诱发和增强机体免疫反应、参与血管新生及肿瘤细胞生长等。

 

3.1外泌体的除废和信号传导作用

 

起初,外泌体一直被认为是细胞排弃掉无用的蛋白及RNA的手段,这对于细胞是有利的。但是,后来的研究发现,外泌体微小的体积能够灵活地避免巨噬细胞的吞噬和穿越血管壁及细胞外基质,及时有效地传递信息分子,完成细胞间的信号传导。Obregon等研究发现,脂多糖(lipopolysaccharideLPS)刺激树突状细胞(dendritic cellsDCs)数小时后释放的外泌体刺激正常的单核细胞再培养后,可检测到单核细胞具有了抗原递呈的能力。该实验说明外泌体具有信息传递作用。

 

3.2外泌体的免疫作用

 

不同细胞来源的外泌体含有不同的组成成分,导致其所发挥的作用也略有不同。因此,外泌体对于免疫系统的调控既有促进作用,也有抑制作用。研究发现,DCs来源的外泌体富含主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ类分子、特异性抗原肽、CD80CD86等蛋白成分,它们具有抗原呈递作用,可诱导特异性免疫发挥免疫激活作用。2013Zhang等的实验发现,骨髓干细胞(marrow stromal stem cellsMSCs)来源的外泌体可激活MYD-88依赖的信号通路,使单核细胞转化为M2表型,进而CD4+T细胞极化激活成调节性T细胞,从而延迟免疫反应。

 

3.3外泌体的促血管新生及肿瘤细胞生长作用

 

外泌体的促血管新生作用多见于心脏及肾脏损伤修复中,主要原因是外泌体内含有具有心脏及肾脏损伤修复作用的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF)。Zhang等构建的缺血模型中,大剂量的MSC来源的外泌体能够明显加快血管损伤后血流的通畅;并且一些体外实验也证实MSC来源的外泌体可以促进内皮细胞的生长和增殖,这些都表明MSC来源的外泌体具有促进血管生成的作用。精氨酸酶-1Arg-1)等活性分子可以抑制特异性和天然的抗肿瘤免疫,而外泌体能够高表达它们,从而使肿瘤细胞逃离免疫,达到促肿瘤细胞生长的作用。

 

4.外泌体在慢性炎症方面的研究

 

临床上,我们经常可以在血液循环中发现外泌体,它是细胞对炎症发生的反应性行为,并且数量与川崎病、动脉粥样硬化、糖尿病和代谢综合征等常见疾病相关的慢性炎症的严重程度有关。

 

4.1心脑血管疾病

 

目前的研究发现,在动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、缺血性脑卒中和恶性高血压等一些疾病的血液中都可检测到内皮细胞来源外泌体的增高,所以内皮细胞在活化或凋亡时所释放的外泌体,能够作为血管损伤和功能障碍的标志物之一。Jansen等研究发现,内皮细胞被高糖诱导后释放的外泌体能够促进巨噬细胞浸润及炎性细胞聚集,增加黏附蛋白的表达,从而促单核细胞黏附,起到促炎的作用。

 

Loo等研究还发现,从心肌梗死患者外周血中提取的外泌体作用于Th-1细胞可增加T-βmRNA和相应蛋白的表达,既能促进外周血中CD4+T淋巴细胞向Th-1分化,又能促进干扰素(INF-γ和肿瘤坏死因子(TNF-α大量生成。这些结果都提示我们,某些病理状态下产生的内皮细胞源性外泌体能够促进树突状细胞及Th-1的分化及功能,从而参与相关的炎症免疫反应。

 

4.2肝脏炎症

 

在先天免疫系统中,从病毒感染的细胞中释放出的外泌体包含树突状细胞和巨噬细胞的病毒RNA,释放后可激活受体细胞中的模式识别受体(pattern recognition receptorsPRRs),如Toll样受体和RIG-1样受体,这将导致Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的表达。另外,外泌体不仅可以转运病毒RNA,而且还能将miRNA转移到受体细胞。据Dreux等报道,丙型肝炎病毒(HCVRNA被包裹在从HCV感染的肝细胞中释放的外泌体内,携带HCVRNA的外泌体激活pDC,导致Ⅰ型干扰素的产生。除此以外,在其他病毒研究中也检测到了外泌体内病毒RNA的包装。以上的证据都表明,从被病毒感染的肝细胞中释放的外泌体可将病毒RNA转移到受体细胞,包括DCs和巨噬细胞,从而诱导先天的免疫应答。

 

4.3中枢感染性疾病

 

中枢神经系统的慢性炎症疾病主要由朊蛋白、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virusHIV)、人类嗜T细胞病毒(human T lymphotropic virusHTLV)等病原体侵入宿主细胞引起。被感染的宿主细胞分泌的外泌体可包裹病原体的核酸或蛋白,从而提高病原体的感染力或致病力。以朊蛋白为例,正常和异常的朊蛋白均可分泌外泌体,在朊蛋白致病过程中,包裹异常朊蛋白的外泌体起到重要作用,并使该疾病在动物或细胞间传染。

 

据报道,朊蛋白病传染过程中外泌体携带的大量脂筏参与了新的异常朊蛋白的生成。并且,朊蛋白感染神经元后释放的外泌体miRNA表达谱与正常神经元的不同,这可为该病的早期诊断提供线索。

 

5.外泌体在口腔领域的研究展望

 

目前,在口腔领域有关外泌体的研究正在日益增加,从最初的只涉及肿瘤疾病及与自身免疫有关的黏膜病方面,到目前已有报道关于上皮间充质转化、牙髓组织再生以及牙周膜干细胞方面的研究,说明外泌体在口腔医学领域的潜在价值正在被科学家们不断探索中,而且还有很大的研究空间。

 

2016年,Sento等从口腔鳞癌细胞中分离出外泌体,它不仅可被口腔鳞癌细胞吸收,也能通过激活体外PI3K/AktMAPK/ERKJNK-1/2途径促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。然后通过用PI3KERK-1/2JNK-1/2药物抑制剂作用于相应的外泌体,他们发现外泌体的促肿瘤细胞生长作用明显减弱。这表明口腔鳞癌细胞释放的外泌体很可能是一种新的治疗靶点,为其临床治疗开辟了一条新的途径。此外,研究者发现口腔上皮细胞共培养爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)阳性B细胞时可诱导病毒的再激活,因为来源于口腔上皮细胞的外泌体内含miR-200家族的miRNA,后者可促进EBV裂解复制。

 

口腔上皮细胞分泌的外泌体可作为组织特异性环境线索,启动B细胞中病毒的再激活,促使病毒从外周B细胞转移到口腔上皮,以促进病毒扩增和交换到其他宿主。所以这种细胞间通讯途径可作为B细胞识别合适环境来引发再激活的传感器机制,从而允许病毒与口腔上皮交换。在人类口腔组织的发育过程中,上皮和间充质的相互作用对于头颈部皮肤、毛囊、主要腺体和牙齿的发育至关重要。2017年,Jiang等研究了口腔器官发生过程中细胞外泌体在上皮-间充质相互作用中的一些功能。研究表明,发育中的牙齿组织的上皮和间充质可分泌直径小于100nm的外泌体,并通过基底膜向外扩散。

 

外泌体相互诱导细胞分化和基质合成:上皮来源的外泌体诱导间充质细胞产生牙本质涎蛋白并进行矿化,而间充质来源的外泌体诱导上皮细胞产生基底膜成分、成釉蛋白和褪黑素。并且上皮来源的外泌体内含miR135a,能激活Wnt/β-连环蛋白信号传导并增加牙本质基质蛋白的间充质产生和部分可逆的Antago-miR135a减毒。这些都说明外泌体可能介导器官发育中的上皮-间充质转化,并且外泌体和(或)它们正在运输的分子内容可能是治疗疾病或组织再生的介入。

 

在研究多发性硬化症患者抵御脑脊髓炎时,研究者发现从健康供体阻断实验性自身免疫性脑脊髓炎获得的人牙周膜干细胞来源的条件培养基和纯化的外泌体,可以减少促炎性细胞因子IL-17IFN-γ、IL-1β、IL-6TNF-α的分泌,并诱导抗炎症细胞因子IL-10的产生。此外,凋亡相关的STAT1p53Caspase3Bax表达减弱。其研究结果揭示了人牙周膜干细胞在自身免疫性脑脊髓炎炎症过程中的免疫抑制作用,这也为我们探索人牙周膜干细胞在口腔慢性炎症过程中发挥的免疫作用提供了一个好的借鉴。

 

为了规避由于使用生长因子和生长因子递送系统而引起的众多问题,科学家们正在探索使用不同来源的外泌体作为仿生工具来诱导干细胞分化。实验结果表明,牙髓细胞分泌的外泌体可以结合基质蛋白,如Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白,使它们能够连接到生物材料。并且牙源性分化细胞和人骨髓来源的基质细胞可通过细胞内吞机制以剂量依赖性和饱和方式吞噬外泌体,并触发P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。另外,牙髓细胞来源的外泌体也促进牙源性分化所需基因的表达增加。

 

当用牙源性分化细胞在牙根切片模型中进行体内测试时,外泌体诱导了牙髓样组织的再生。简单地说,在牙源性条件下分离的外泌体是更好的干细胞分化和组织再生的诱导剂。这个研究提供的数据可作为我们进一步研究在特定条件下培养的细胞中使用细胞类型特异性外泌体以在靶干细胞中引起特异性应答的可能性的起点。但这需要进一步的研究来描述由外泌体触发的早期(内吞作用介导的)和晚期(miRNA介导的)信号传导机制之间的差异,以理解作用特异性背后的机制。

 

我们可以对外泌体在口腔领域的应用做如下设想:可以大量生产纯化的外泌体,冻干并商业化分配用于自体干细胞和现有的临床材料,如再生牙髓中的胶原海绵。外泌体作为细胞间物质和信息交流的重要载体,在心脑血管、肝脏、肾脏等系统疾病的发生、发展及损伤修复方面发挥了关键性的作用。在临床应用中关于外泌体的研究正在如火如荼地进行着,其作为诊断标志物及药物载体的应用也正在被深入开发。然而在口腔领域,对于外泌体的相关研究少之又少,外泌体的功能及应用具有很大的潜在研究前景,所以需要我们进行更深入的探索和验证,以便更多地用于口腔临床的诊断与治疗。

 

来源:刘娜娜,郑妍,林莉.外泌体的作用及其在口腔领域的研究展望[J].中国实用口腔科杂志

 

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