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缉拿细胞凋亡背后真凶,我有一大法宝!

       在科研界,细胞凋亡检测实验绝对占据了细胞实验领域中的半壁江山,现应医学科研者之命,带来尚方宝剑一套——透射电镜检测细胞凋亡详解中洪君(微信zhbybio)助你早早发表高分文章、走上人生巅峰!


细胞凋亡


       细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。 

       细胞凋亡是由不同的刺激物引起的,包括位于死亡受体结扎(外在途径)或线粒体(内在途径)。对死亡受体的刺激可诱导caspase-8和-10的活化,并随后引起下游效应caspase的裂解。线粒体通过内源性通路参与,而内源性通路可由不同类型的应激引发。线粒体膜通透性受促凋亡和抗凋亡Bcl2家族成员(Bax、Bak、Bcl2和Bcl-XL、mcl1、PUMA和NOXA)的对立作用平衡调控。线粒体凋亡因子可通过凋亡诱导因子(AIF)和内切酶G (Endo G)诱导caspase独立凋亡,从线粒体释后,SMAC/DIABLO或OMI/HTRA2可抑制XIAP,启动caspase-9活化,随后激活内在通路。上图为细胞凋亡分子机制简图。


       具有凋亡特征的细胞程序性死亡后,可在扫描或透射电镜下观察到“凋亡小体”,该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡,其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬,借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是并非所有发生程序性死亡的细胞皆形成凋亡小体。


仪器和试剂


      射电子显微镜或扫描电子显微镜,组织切片机,离心机,离心涂片机。戊二醛固定液:取25%戊二醛原液10ml,加入0.2mol/L PBS液50ml,再加入蒸馏水40ml,混匀,4℃保存。


       锇酸固定液:将含有1g锇酸的小瓶浸入清洁液过夜,用双蒸水冲洗数遍后,将小瓶放在盛有50ml双蒸水的100ml棕色磨口瓶内,击破锇酸小瓶使其内锇酸溶于水,1~5ml小瓶分装,避光,4℃保存。用时再稀释1倍成1%的应用液。


操作步骤详解


       A.离心收集约5×106 细胞,用PBS洗涤两次后,弃上清,加1ml 2.5%戊二醛悬浮细胞,移入1.5ml Ep管中,室温下4 000r/min离心15min,固定细胞0.5~1h;

       B.在磷酸缓冲液里漂洗1~2h或更长时间,尽量将戊二醛冼净,用1%的锇酸固定液固定30min~1h;

       C.固定完毕后加入50%乙醇脱水10min→70%乙醇10min→90%乙醇10min→90%丙酮10min→100%丙酮三次各10min;

       D.丙酮与环氧树脂1:1包埋2h,再放入纯包埋剂(环氧树脂包埋全浸透)数小时或过夜;

       E.环氧树脂包埋,62℃烤箱二天,进行超薄切片,用醋酸铅铀双染法进行切片染色;

       F.在透射电子显微镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化,照相并记录实验结果;


结果判断


       电子显微镜是观察细胞形态最好的方法,细胞核和细胞器的结构清晰易辨。凋亡细胞染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体,细胞浆浓缩,内质网变疏松并与胞膜融合,形成一个个空泡,线粒体结构无明显改变。细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。坏死细胞的染色质稀疏呈细颗粒状,分布无规律,边界不清,细胞浆肿胀,细胞器结构破坏,细胞膜不完整。


透射电镜观察细胞凋亡示例


 

       TEM的中央角膜后基质细胞1 h(图3)或4 h(图3 b)机械内皮损伤后显示后基质细胞与细胞凋亡的超微结构变化,包括染色质缩合和凋亡体的形成包含细胞的胞质内容。只有正常的无凋亡迹象的基质细胞被检测到没有机械内皮损伤的角膜。角膜后基质细胞的透射电镜检查,内皮损伤和控制未受伤的眼角膜。a . 1 h机械内皮损伤后,上覆后基质细胞显示细胞凋亡的形态学变化,包括染色质缩合(cc)和凋亡的身体(箭头)的形成包含细胞质和细胞器的细胞死亡。这些凋亡体分散到周围基质层膜(mag. 22000 x)。这些细胞凋亡的TEM形态学变化特征在大多数有内皮损伤的角膜后10%-20%的间质细胞中被发现(未见)。凋亡细胞包括角化细胞、常驻免疫细胞、常驻间充质干细胞、非髓化施旺细胞、髓化施旺细胞,甚至骨髓源性细胞。b。同样,在机械内皮损伤后4 h,染色质缩合形成(cc)和凋亡的身体(箭头)指出在一个后基质细胞(mag 41000 x)。这些超微结构的改变在大多数后侧间质细胞中被发现,这些细胞在所有受伤的角质层表面前10-20%的深度(未显示)。C.在没有机械内皮损伤的控制角膜中,后基质细胞具有正常的超微结构,其细胞核密度不均匀,细胞质中有细胞器(箭头),没有凋亡体(mag. 41000 x)。未损伤的角质层中未检出提示细胞凋亡的间质细胞(未见)。

 


       C2C12细胞的组织病理、超微结构改变及Hoechst染色。对照组C2C12细胞与氟的形态学变化在(a)和(b)中分别显示为一组,在(a)和(b)中可见正常的组织病理学结构,在(b)中暴露于过量氟化物的C2C12细胞的核结和变形,细胞间的间隙也明显增大。(A)对照组C2C12细胞超微结构正常。(A1)和(A2)为C2C12细胞的正常线粒体(Mi)、内质网(ER)和核膜(NM)。(B)显示C2C12细胞暴露在过量氟化物下的超微结构,核反应清晰可见。(B1)和(B2)显示线粒体空泡和ER肿胀。(C)和(D)显示C2C12细胞的Hoechst染色结果。(D)显示阳性细胞的数量比对照组增加,细胞的颜色变淡。


参考文献

       1. Sabine Hombach-Klonisch, Maryam Mehrpour, Shahla Shojaeia. Glioblastoma and chemoresistance to alkylating agents: Involvement of apoptosis, autophagy, and unfolded protein response. Pharmacology and Therapeutics 184 (2018) 13–41.

       2. Mohammad Hasanzadeh , Nasrin Shadjou , Miguel de la Guardia.Early stage diagnosis of programmed cell death (apoptosis) using.electroanalysis: Nanomaterial and methods overview. Trends in Analytical Chemistry 93 (2017) 199e211.

       3. Bian-hua Zhou, Pan-pan Tan, Liu-shu Jia. PI3K/AKT signaling pathway involvement in fluoride-induced apoptosis in C2C12 cells. Chemosphere 199 (2018) 297e302.

       4. Carla S. Medeiros, Luciana Lassance, Paramananda Saikia. Posterior stromal cell apoptosis triggered by mechanical endothelial injury and basement membrane component nidogen-1 production in the cornea. Experimental Eye Research 172 (2018) 30–35.


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