蛋白质Western Blot 低成本快速半干转印方法
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-08-30
随着半干转印系统不断进步，有越来越多的方法被应用于加速转印过程。例如，用户可以通过更换转印缓冲液、使用不同的转印装置，或调整转印条件、修改实验设计，从而缩短实验时间。这些方法对需要快速得到结果并做出正确判断的用户非常有用，比如从事临床检验工作的用户。使用传统半干转印方法过去通常需要40〜60分钟完成一次转印，而现在通过使用快速缓冲液，Yrdimes®半干转印系统可以在7分钟之内完成蛋白质高效快速转印。Yrdimes®半干转印系统可以通过较少的转移缓冲液实现快速和有效的转印，特别是在缩短筛选大量样品所耗时间方面，Yrdimes®半干转印系统可在40〜60分钟内同时运行最多12块7×10cm的丙烯酰胺凝胶。此外，Yrdimes®半干转印系统中配备镀铂钛阳极板和不锈钢阴极板，可实现高度均匀电场，使转印效果更均匀，机器使用寿命更长。
转印缓冲液为两电极间的化学环境提供电学连续性，从而在保持蛋白质溶解度的同时，不对蛋白质与固相转印膜的结合产生阻碍。转印缓冲液的成分会影响转印时间，使用通常传统实验用缓冲液在Yrdimes半干转印系统中，需要约40分钟转印样品，现在，使用Pierce®快速半干转印缓冲液，实验证明通过Yrdimes半干转印系统只需在7〜10分钟内即可完成快速转印。
材料
• 膜：0.45μm孔径的PVDF膜（PolyScreen®转印膜，PerkinElmer™)
• Yrdimes®半干转印系统（Wealtec）
• V-GES垂直电泳系统（Wealtec）
• ProMarker Plus（Wealtec）和293T细胞裂解液。
• 考马斯亮蓝染色： 0.5 g CCB/1000 ml MetOH: H2O: AOAC = 45:45:10.
• 脱色溶液：MetOH:H2O:AOAC = 45:45:10。
• PVDF膜脱色溶液：MetOH：AOAC = 90:10。
• Pierce®快速半干转移缓冲液，10X。(Thermo Scientific)
• Elite200电源（Wealtec）
• Dolphin-Doc 和 Dolphin-Chemi 的凝胶成像分析系统（Wealtec）
• 抗鼠β-肌动蛋白IgG抗体（Santa Cruz 生物科技公司）
• 山羊抗鼠IgG-HRP抗体（Santa Cruz 生物科技公司）
• 化学发光试剂（Western LightningTM）
方法
• 用Wealtec V-GES灌胶模具制备12％的SDS-PAGE
• 在SDS-PAGE胶中使用ProMarker Plus或293T细胞裂解液作为样本，用Elite 200电泳仪供电进行垂直电泳分离。浓缩胶80V/20分钟，分离胶120V/80分钟。
• 在此期间，用1:10比例的去离子水稀释10× Pierce®快速半干转移缓冲液，并在使用前搅拌均匀。
• 在稀释过的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡四张转印纸（〜1.25 mm）和两张超厚滤纸（约2.5 mm）10〜15分钟，轻轻振荡摇匀。
• 用甲醇预润湿PVDF膜1分钟，蒸馏水数分钟，并在稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡10〜15分钟。
• 电泳完成后，在超纯水中平衡SDS-PAGE10〜15分钟，轻轻振荡摇匀。
• 将SDS-PAGE放入稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中，轻轻混合振荡10〜15分钟使平衡。
• 在Yrdimes转印槽的阳极板上将转印膜与凝胶的夹层组装起来，确保消除凝胶-膜各层之间的气泡。
• 合上Yrdimes的上盖向下按压弹簧锁，闭合上盖。
• 用恒压25 V转印7〜10分钟。
• 在此之后，按照如下步骤染色：
（a）考马斯亮蓝染色：
（ⅰ）使用考马斯亮蓝染色溶液给SDS-PAGE电泳和PVDF膜着色30分钟。
（ii）分别采用各自去色溶液去除着色
（iii）使用Dolphin-DOC凝胶成像分析系统拍照保存。
（b）化学发光反应：
（ⅰ）用TBST缓冲液洗涤PVDF膜10〜30分钟。
（ⅱ）将PVDF转到带有抗小鼠β肌动蛋白IgG抗体（1：1000）的TBST缓冲液1小时。
（ⅲ）使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟，重复三次。
（ⅳ）使用山羊抗 - 小鼠IgG-HRP抗体将PVDF转至TBST缓冲剂中按照（1：3000）的比例浸泡1小时。
（ⅴ）使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟，重复三次。
（vi）使用ECL化学发光试剂进行染色。
（vii）使用Dolphin-Chemi mini成像系统进行拍摄。曝光1分钟并进行10次叠加。
图1. ProMarker Plus在不同条件下的转印效率。使用5V(A)(B)与25V(C)(D)恒电压用Yrdimes转印7分钟，25V转印10分钟(E) (F)。左侧是SDS-PAGE胶，右侧是转印后的PVDF膜。
图2. 从SDS-PAGE胶向PVDF膜以25V电压转印7分钟后，在系列稀释的293T细胞裂解液中检测到β-actin。图中数字代表加载的293T细胞裂解液中的总蛋白含量。
讨论
转印缓冲液为两电极间的化学环境提供电学连续性，从而在保持蛋白质溶解度的同时，不对蛋白质与固相转印膜的结合产生阻碍。转印缓冲液的成分会影响转印时间，使用通常传统实验用缓冲液在Yrdimes半干转印系统中，需要约40分钟转印样品，现在，使用Pierce®快速半干转印缓冲液，实验证明通过Yrdimes半干转印系统只需在7〜10分钟内即可完成快速转印。
材料
• 膜：0.45μm孔径的PVDF膜（PolyScreen®转印膜，PerkinElmer™)
• Yrdimes®半干转印系统（Wealtec）
• V-GES垂直电泳系统（Wealtec）
• ProMarker Plus（Wealtec）和293T细胞裂解液。
• 考马斯亮蓝染色： 0.5 g CCB/1000 ml MetOH: H2O: AOAC = 45:45:10.
• 脱色溶液：MetOH:H2O:AOAC = 45:45:10。
• PVDF膜脱色溶液：MetOH：AOAC = 90:10。
• Pierce®快速半干转移缓冲液，10X。(Thermo Scientific)
• Elite200电源（Wealtec）
• Dolphin-Doc 和 Dolphin-Chemi 的凝胶成像分析系统（Wealtec）
• 抗鼠β-肌动蛋白IgG抗体（Santa Cruz 生物科技公司）
• 山羊抗鼠IgG-HRP抗体（Santa Cruz 生物科技公司）
• 化学发光试剂（Western LightningTM）
方法
• 用Wealtec V-GES灌胶模具制备12％的SDS-PAGE
• 在SDS-PAGE胶中使用ProMarker Plus或293T细胞裂解液作为样本，用Elite 200电泳仪供电进行垂直电泳分离。浓缩胶80V/20分钟，分离胶120V/80分钟。
• 在此期间，用1:10比例的去离子水稀释10× Pierce®快速半干转移缓冲液，并在使用前搅拌均匀。
• 在稀释过的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡四张转印纸（〜1.25 mm）和两张超厚滤纸（约2.5 mm）10〜15分钟，轻轻振荡摇匀。
• 用甲醇预润湿PVDF膜1分钟，蒸馏水数分钟，并在稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡10〜15分钟。
• 电泳完成后，在超纯水中平衡SDS-PAGE10〜15分钟，轻轻振荡摇匀。
• 将SDS-PAGE放入稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中，轻轻混合振荡10〜15分钟使平衡。
• 在Yrdimes转印槽的阳极板上将转印膜与凝胶的夹层组装起来，确保消除凝胶-膜各层之间的气泡。
• 合上Yrdimes的上盖向下按压弹簧锁，闭合上盖。
• 用恒压25 V转印7〜10分钟。
• 在此之后，按照如下步骤染色：
（a）考马斯亮蓝染色：
（ⅰ）使用考马斯亮蓝染色溶液给SDS-PAGE电泳和PVDF膜着色30分钟。
（ii）分别采用各自去色溶液去除着色
（iii）使用Dolphin-DOC凝胶成像分析系统拍照保存。
（b）化学发光反应：
（ⅰ）用TBST缓冲液洗涤PVDF膜10〜30分钟。
（ⅱ）将PVDF转到带有抗小鼠β肌动蛋白IgG抗体（1：1000）的TBST缓冲液1小时。
（ⅲ）使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟，重复三次。
（ⅳ）使用山羊抗 - 小鼠IgG-HRP抗体将PVDF转至TBST缓冲剂中按照（1：3000）的比例浸泡1小时。
（ⅴ）使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟，重复三次。
（vi）使用ECL化学发光试剂进行染色。
（vii）使用Dolphin-Chemi mini成像系统进行拍摄。曝光1分钟并进行10次叠加。
讨论
在结果中，在Yrdimes半干转印槽中使用Pierce快速半干转印缓冲液，被证明使用25V恒电压条件下7分钟可以达到非常好的转印效果 (图一)，转印 后，膜上的蛋白质也可以通过免疫学步骤用ECL化学发光染剂染色（图二）。对比图1中使用的不同恒定电压之间转印效果，我们发现使用Yrdimes®半干转印系统电压恒压25 V（同时也是转印缓冲液推荐电压）将得到最好的转印效果。通过使用不同长度时间，可以看出只需要7分钟即可完成很好的转印效果。10分钟转印后，将有高达90%的蛋白质被转移到PVDF膜上。虽然转印效果会随着时间延长而提升，我们并不推荐转印超过10分钟。因为转移超过十分钟后，转移效率并不会有显著增加，不仅如此，该过程还会产生更多的热量并且增加了对凝胶和样品的损害可能，这是因为对Yrdimes®半干转印系统施加了25伏特的超高恒定电压的缘故。 如图2所示，该系列稀释样品的强度会随着样品数量的降低而减小。 这也证明了Yrdimes®半干转印系统可以很均匀地传输当与Pierce®快速半干式转移缓冲液一起使用时，该缓冲液对筛选大量样品非常有帮助。这篇文章证明了Yrdimes®半干转印系统可以在Pierce®快速半干式转移缓冲液辅助下，将蛋白质从SDS-PAGE电泳高速高效转印到PVDF膜上。实验结果表明Wealtec Yrdimes®半干转印系统不仅为用户提供了一个更快捷的蛋白样本转印方案，更展示了该系统的操作灵活性、易用性。
此文转载于：丁香通
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