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细胞生长曲线的绘制(MTT法)

1 无菌培养实验室准备(同细胞传代培养),从CO2培养箱中去除细胞,弃去培养液,加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞,弃去胰蛋白酶液,使用新的含10%小牛血清的培养基制成细胞悬液后计数。

2 按照4×103细胞/孔接种于96孔板,0.2ml培养基/孔(如果是悬浮细胞,则0.1ml培养基/孔),做传代培养。设置3个空白对照孔,只加无细胞的培养基。

3 24h后加入待检药品,可加入几种不同浓度的待检药品。对照组不加药,24h时选取其中3个孔更换新鲜培养基100ul,加入0.01mlMTT5mg/ml)放回37℃孵育4h,之后加入100ul的裂解液,37℃过夜。

5 5天后统一在酶标仪上于570nm下检测,得出OD值(或者加入裂解液后过夜每天检测)。以空白对照调节零点。

注意事项:

1 接种细胞要准确,接种时要充分使细胞混匀,防止细胞沉淀造成细胞接种不均。

2 MTT溶液见光后颜色会逐渐变深,因此在加入裂解液后96孔培养板应避光孵育/处理。

3 可以在全部MTT实验做完后一起上机检测OD值,但前提是前面已经做完了的须避光处理。也可采取加入裂解液后每天检测一次OD值,但使用的酶标仪应该性能稳定,隔天检测结果应一致。

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