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【动物实验】-补肾填精方对雷公藤多甙诱导卵巢早衰大鼠模型的影响

背景:原发性性腺功用减退症定义为卵巢功用不全伴有高血清卵泡刺激素(FSH)程度。在女性中,原发性性腺功用减退症的一个最常见的方式是卵巢早衰(POF),也被称为过早绝经。可能是由于卵泡丧失率增加,卵巢发育过程中卵泡数量减少或卵泡对激素刺激反响愚钝,表现为闭经、促性腺激素升高、月经周期不规则。以前的研讨以为POF是一种异质性致病背景的疾病,已知POF的病因包括遗传异常、本身免疫性疾病和环境凌辱,以及手术、放疗和药物治疗后的医源性损伤。卵巢早衰的治疗主要包括激素替代治疗和不孕症治疗。HRT能够补偿POF患者的雌激素缺乏,从而减轻更年期病症。但是,由于乳腺癌、心脏病发作和中风的风险增加,人们对这种疗法提出了越来越多的关注。因而,HRT通常是卵巢早衰的最后手腕,在最短的时间内应采用最低剂量。近年来,中医药以其疗效、平安、低本钱等优点,惹起了人们对女性生殖功用障碍的注重。BRT和HRT的组合显现对POF患者治疗效果显著,显著改善月经状态和血清性激素程度。BTR包含四局部组成,熟地黄、白芍、龟板龟板鳖甲和山茱萸。在体外和体内的研讨标明,从这些成分中别离出的主要生物活性化合物对卵巢疾病具有抗衰竭作用或药理作用。更重要的是,促血管生成和抗凋亡信号传送与这些化合物的生物活性有关。因而,我们揣测,BTR对POF的作用可能是经过促血管生成和抗凋亡机制介导的。

为了考证这一假定,在本研讨中,我们调查了BTR对雷公藤多苷(TG)致卵巢早衰大鼠模型的影响。

办法:动物与卵巢早衰诱导:一切动物护理和治疗均严厉依照机构指导方针停止。成年雌性SD大鼠(体重180-220 g,12周龄)饲养在室温25±1°C,湿度50±5%, 12小时的光/暗周期环境中。一切的动物自在采食和饮水。实验之前,顺应动物设备1周。50只发情周期正常的动物作为实验对象,每天停止阴道涂片连续剖析10天。挑选出的动物随机分为五组各十只:对照组、卵巢早衰模型组,BTR低剂量组、BTR中剂量组和BTR高剂量组。对照组:4毫升0.9%的生理盐水每日两次(上午9:00和下午3:00),灌胃给药,连续15天。卵巢早衰模型组:上午9:00 TG 50毫克/公斤,下午3:00 TG 50毫克/公斤加4 mL 0.9 %生理盐水,灌胃连续15天。BTR低剂量组:上午9:00  TG  50毫克/公斤,下午3:00  TG  50毫克/公斤加1.88克/公斤BRT,灌胃连续15天。BTR中剂量组:上午9:00  TG  50毫克/公斤,下午3:00  TG  50毫克/公斤加3.75克/公斤BRT,灌胃连续15天。BTR高剂量组:上午9:00  TG  50毫克/公斤,下午3:00  TG  50毫克/公斤加7.50克/公斤BRT,灌胃连续15天。

发情周期评价和样品采集:在用药期间,每种动物的发情周期都是依照先前描绘的办法停止阴道涂片剖析。一个周期的长度被肯定为两个非连续日发情细胞学察看期间的天数。发情周期≥15天被定义为中止循环。当发情周期数≥2时,计算每种动物发情周期的均匀长度。给药15天后,发情的动物(依据阴道涂片剖析)在发情前期(在最后一次给药后1 - 5天内)被处死。那些中止发情周期循环的动物在最后一次用药后的当天就被处死了。处死前取动物股动脉血标本。处死后,取两个卵巢并用电子天平称重。依据以下公式计算各动物卵巢指数:卵巢指数=双侧卵巢湿重(mg)/体重(g)×100%。

血清E2、FSH、P、T程度的测定:运用商业化的放射免疫试剂盒测定每个动物的血清E2,卵泡刺激素(FSH),P和T程度。每项化验反复停止,计算均匀值。

组织学剖析:组织化学剖析,每一种动物的左侧卵巢固定于4%中性甲醛固定,石蜡包埋,并切成3-5μm厚。用苏木精-伊红染色。切片100×放大倍数下察看并拍摄。停止细胞凋亡的定量评价,每只大鼠五局部随机在400×镜下拍照。随后,随机选择十个非堆叠的高倍视野(HPFS)计算颗粒细胞凋亡数量。计数是由两个独立的剖析师停止的,他们对治疗分组不分明,并记载了均匀值。

免疫组化剖析:免疫组化剖析停止检测不同处置组卵巢切片VEGF、VEGFR2、Bcl-2、Bax和Caspase 3的表达。每个动物的右卵巢被固定于4%中性缓冲甲醛溶液2 h。将固定样品用梯度乙醇溶液脱水,石蜡包埋,切成3~5μm。运用商业化免疫组化试剂停止免疫组化染色。最后,切片DAB显色, HE染色,并在100×拍照。评分规范:0,无染色;1,弱染色;2,中度染色;3,强染色。

结果:TG诱导的卵巢早衰大鼠模型BTR恢复异常发情周期和改善卵巢指数:在实验过程中,POF模型组的一只动物由于不明缘由死亡,随后的数据被丢弃。我们对不同组别动物的发情周期和卵巢指数停止了研讨。5天的TG诱导后,POF模型组与对照组相比,食物摄入量、自发活动和刺激反响减少。三个BTR治疗组,动物的食物摄入量坚持不变,没有察看到异常行为。在TG诱导的15天内,POF模型组的大多数动物显现动身情周期中止,其他的发情周期比对照动物长。但是,这个TG诱导的异常发情周期明显被BTR以剂量依赖的方式抵消。高剂量的BTR显现同对照组的动物相似的发情周期。

治疗完毕后,对各组卵巢停止解剖检查,计算各组卵巢指数。POF模型组卵巢指数较对照组显著降低。TG诱导卵巢指数减少能够被不同浓度的BTR以剂量依赖的方式抵消。这些结果标明,BTR能够恢复发情周期异常,改善TG诱导的卵巢早衰。

BTR对TG诱导的卵巢早衰模型血清E2、FSH、P程度的影响:卵巢早衰时,卵巢在恰当的促性腺激素刺激下不能正常活动,因而不能产生正常的性激素。以前的研讨曾经报道POF与血清E2程度降低及血清P、FSH和T程度升高有关。丈量各组动物血清E2、FSH、P和T的程度。讨论BTR对这些生殖激素分泌的影响。与对照组相比,POF模型组动物的血清E2程度显著降低,FSH、P、T程度显著升高。这些TG诱导的变化是由BTR以剂量依赖的方式显著阻止,标明BTR能改善POF相关的生殖激素异常分泌。

BTR对TG诱导的卵巢早衰模型的初级卵泡、生长卵泡以及黄体功用的影响:POF表现为发育卵泡数量减少,从而影响生殖活动。停止卵巢切片组织学剖析讨论BTR对TG诱导的卵巢早衰模型初级卵泡、生长卵泡和黄体功用的影响。对照组的染色切片显现正常皮质和髓质,不同时期有多个成熟卵泡。可见黄体,但无滤泡性卵巢囊肿或黄体血肿。在皮质或髓质中均未发现炎性细胞浸润或卵巢纤维化。在POF模型组,皮质和髓质的组织学异常,原始卵泡和初级卵泡数量明显减少,卵母细胞发育退化成熟卵泡较少。在切片中也可见卵巢间质纤维化、黄体退化坏死、炎性细胞浸润和血管扩张。三个BTR治疗组,切片显现TG诱导的病理变化被BTR明显减轻。BTR中、高组组织学接近正常组织与控制组。

BTR对TG诱导的卵巢早衰模型大鼠卵巢内VEGF和VEGFR2表达的影响:卵巢切片组织学剖析显现各组血管形态改动。停止免疫组织化学染色察看BTR对TG诱导的卵巢早衰模型的两个关键的促血管生成因子,VEGF和VEGFR2,卵巢内的表达。与对照组相比,POF模型组样本显现免疫组化染色强度明显降低,而染色降落被BTR以剂量依赖方式显著恢复。半定量免疫组化评价的结果也证明了这些发现。TG诱导的POF减少卵巢VEGF和VEGFR2表达。

BTR维护TG诱导的卵巢早衰大鼠模型减少颗粒细胞凋亡:研讨BTR对TG诱导的卵巢早衰大鼠模型颗粒细胞凋亡的维护作用。对照组卵巢染色切片显现多数颗粒细胞安康,无凋亡迹象。在POF模型组中,细胞致密,外形不规则,细胞核小而致密。此外,细胞凋亡晚期细胞核碎裂,产生空泡化和凋亡小体。BTR治疗组显现颗粒细胞多数有完好的细胞膜和细胞核明晰. 定量剖析标明,凋亡细胞的比例在一切BTR治疗组降落,特别是BTR高剂量组。结果标明,BTR能维护TG诱导的卵巢早衰模型大鼠卵巢颗粒细胞减少凋亡。为了进一步考证组织学检查的结果,研讨了BTR几个细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达。与对照组相比,卵巢早衰模型组的bcl-2显著降低,bax和caspase 3显著升高。但是,这些变化被BTR以剂量依赖的方式逆转。

结论:目前的研讨显现,BTR对TG诱导的大鼠卵巢早衰治疗是有效的。组织学和免疫组化结果剖析标明,促进血管生成和抗凋亡是两种可能受BTR影响的机制。

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