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多药抗药基因的表达实验

     多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测特定基因的过度表达。


实验方法原理

      大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。


实验材料

      RNA


试剂、试剂盒

      PBS   氯仿   异丙醇   萘酸   异硫氰酸肽   十二烷基肌酸钠    构橼酸钠   乙酸钠   二疏基乙醇   乙醇   Taq酶


仪器、耗材

      离心机   紫外分光光度计   琼脂糖凝胶电泳   PCR仪


实验步骤

一、细胞总RNA提取
      1.  收集约5×107个细胞,冷PBS洗涤。
      2.  加入400 ul RNA提取液(含6 mol/l 的异硫氰酸肽,0.5%十二烷基肌酸钠,0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0,0.25 mol/l 乙酸钠,pH4.0,0.5%二疏基乙醇,50%萘酸),混匀。
      3.  加入400 ul 氯仿,混匀,以13 000 r/min 于4℃离心15 min。
      4.  取上清液加入等体积的异丙醇,4℃放置30 min。
      5.  然后以13 000 r/min 离心15 min,吸上清,将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次,溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。
      6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280应为1.8~2.0)后备用。


二、反转录及PCR扩增
      1.  引物
 


      2.  取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中,42℃保温30 min 进行反转录,合成cDNA。

      3.  然后置95℃,3 min 终止反转录。

      4.  接着在Taq酶的作用下,用mdr-1和β2-MG引物,对cDNA上的目的片段进行PCR

      5.  94℃预变性2 min,然后94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,扩增35个循环。

      6.  最终在60℃保温7 min,以保证产物充分延伸。

      7.  取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下照相,与mdr-1 cDNA阳性对照,等位的DNA条带为阳性,反之为阴性。


此文转载来源:丁香通



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