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免疫共沉淀六

RIPA Buffer 配置 1. 基础成分 (1) Tris-HCl (防止蛋白变性的缓冲液成分) (2) NaCl (防止非特异性蛋白聚集的盐分) (3) NP-40 (用 H2O 配置成 10% 储存液。 NP-40 为非离子去污剂,用于

免疫共沉淀五

15. 14000rpm 瞬时离心 5s ,去上清,收集琼脂糖珠 - 抗原抗体的复合物。 16. 用 800ul 预冷 RIPA buffer 冲洗 3 遍。 17. 用 60ul 2 倍上样缓冲液将琼脂糖珠 - 抗原抗体复合物悬起,轻轻敲打混匀。

免疫共沉淀四

具体步骤: 8. 4 ℃, 14000g 离心 15min ,将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度,可选用 Bradford 法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量,分装, -20 ℃保存,可保存 1 个月。 11. 用

免疫共沉淀三

具体步骤: 1. 细胞用预冷的 PBS 液洗涤 2 次,最后洗涤完成后吸干 PBS 液。 2. 加入预冷的 RIPA Buffer ( 1ml/107 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2 培养瓶)。 3. 刮留细胞:用预冷的细胞刮子将细

免疫共沉淀二

优点: 1.于天然状态下相互作用的蛋白质。 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。 3.分离得到相互作用蛋白的天然符合物。 缺点: 1. 低亲和力和瞬间的蛋白

免疫共沉淀一

一、原理: 免疫共沉淀( Co-IP )是以研究蛋白质相互作用的经典方法,其原理基础为抗体 - 抗原之间的专一性作用。在分子病理生物学研究领域, Co-IP 是用以确定两种蛋白在完整细胞

体外SUMO修饰实验五

5. SUMO化蛋白的检测 (1 )培养细胞,待细胞融合至 90% 左右。 ( 2 ) PBS 洗涤细胞 2 次, 0.25% 胰酶消化细胞。 ( 3 ) 1000rpm ,离心 3-5min 收集细胞。 (4) PBS 洗涤细胞 2 次。 (5) 1

体外SUMO修饰实验四

4. 带标签的 SUMO 的制备(以 His-SUMO 为例) (1 )培养细胞、诱导及收获。 ( 2 )每 200ml 菌液收获的菌体加入 5ml His 裂解液,重悬沉淀。 ( 3 )冰浴条件下,超声破碎沉淀。 ( 4 )

体外SUMO修饰实验三

3.SUMO 质粒瞬时转染 (1) 将生长状态良好的细胞接种于直径 4-6cm 的培养皿中, 5% CO2 , 37 ℃培养箱内培养 16-24h ,细胞融合至 60%-90% 时可进行转染。 (2) 转染前 1h 将细胞培养液换成

体外SUMO修饰实验二

2. SUMO 质粒 DNA 的提取 (1) 用 1.5ml 离心管取少量菌液,离心后弃掉上清液。 (2) 用 250ul P1 溶液重悬菌株,漩涡振荡使菌液重新完全悬浮。 (3) 加入 250ulP2 溶液,轻轻涡旋 4-6 次混

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