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蛋白质检测(十二)

七、蛋白印迹实验常见问题及原因分析 1. 没有带? 原因:样品中抗原含量不足(抗原表达量过低;蛋白降解;上样量不足;样品制备错误);制胶浓度比例不合适;转膜不完全;一抗

蛋白质检测(十一)

蛋白印迹法 六 显色 3. 碱性磷酸酶缓冲液: 100ml 配方如下。 1mol/L Tris-HCL(pH 9.5) 10ml 5mol/L NaCl 2ml 1mol/L MgCl2 0.5ml DDW 87.5ml * 冷藏保存,可保存数月。 4. 显色液 100BCIP 0.1ml 100×NBT 0.1ml * 显色后

蛋白质检测(十)

蛋白印迹法 六 显色 2. AP 标记二抗 显色液配置 ( 1 ) 100 × 氯化硝基四氮唑蓝( NBT ): 10ml 配方如下: NBT 0.33g 70% 二甲基甲酰胺 10ml *1.5ml 离心管分装后冷冻保存,可保存数月。 (

蛋白质检测(九)

蛋白印迹法 六 显色 酶和底物反应显色是蛋白印迹法的最后一步,一般常用酶有 HRP 和 AP ,根据成像底物可分为显色底物和发光底物。发光底物可选用 HRP 标记二抗,显色底物可选用

蛋白质检测(八)

蛋白印迹法 5 实验步骤 (1) 封闭结束后,用 PBS-T 液轻轻清洗膜,去除封闭液。 (2) 用一抗室温孵育 1h 或 4 ℃过夜。 (3) PBS-T 液清洗, 10min ×3 次。 (4) 二抗孵育,室温, 1h 。

蛋白质检测(七)

蛋白印迹法 五 抗原 - 抗体反应 4 二抗的处理 (1) 常用二抗: HRP 偶联二抗。也可用碱性磷酸酶标记二抗,但不够灵敏。 (2) 二抗稀释液: PBS/PBS-T 液、 TBS/TBS-T 液、一般的封闭液等

蛋白质检测(六)

蛋白印迹法 五 抗原 - 抗体反应 1 仪器和设备 塑料盒、振荡器。 2 封闭 一般采用 5% 脱脂奶粉进行封闭,室温, 30-60min 。 * 封闭液的浓度可以是( 1%-5% ),根据自己的条件摸索浓度就可

蛋白质检测(五)

蛋白印迹法 四转膜 操作步骤: 1 准备:切好的 PVDF 膜和滤纸置于甲醇 5min , PVDF 膜置于电转缓冲液浸泡 10min 以上。 * 转一张膜需 6 张 6cm ×9cm 滤纸和 1 张 6cm×9cmPVDF 膜,滤纸和膜的尺寸

蛋白质检测(四)

蛋白印迹法 三 电泳 * 考马斯亮蓝法:用 40% 双蒸水 /10% 醋酸 /50% 甲醇的溶液固定胶中蛋白 考马斯亮蓝 R-250 染色室温染色 4h 过夜,保持摇匀 转入 67.5% 双蒸水 /7.5% 醋酸 /25% 甲醇摇匀脱色

蛋白质检测三

蛋白印迹法 三 电泳 电泳条件:电压 200V ,电流 8mA ,染料进入分离胶时电流增加到 16mA ,时间一般 2-3 小时。 * 溴酚蓝刚跑出胶即可终止电泳进行转膜,也可以根据时间经验停止电泳。

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