利用 DNA 聚合酶 I 的大片段（Klenow 酶）的 3＇— 5＇外切酶活性将 3＇黏性末端转化成平末端。具体方法是在体外转录体系尚未加入核苷酸和 RNA 聚合酶时，加入 Klenoow 片段 (终浓度为 5U/ug)，于 22℃ 孵育 15mim, 然后再加入核苷酸混合物和RNA 聚合酶

实验材料

      模板 DNA 或质粒

试剂、试剂盒

      TE   异丙醇   3mol LNaAc   无水乙醇   5×转录缓冲液   l00 mmol L DTT   RNasin   rATP   rGTP   rUTP   各 2.5 mmol L   [α42P   ] rCTPSPG   T3 或 T7RNA 聚合酶   TE-饱和的酚   氯仿   异戊醇   DNase   7.5mol L 乙酸铵   无水乙醇   乙醇   0.5mol LNa2 HPO4琼脂糖

仪器、耗材

      DE81 膜   液闪仪   电泳槽   离心机

实验步骤

一材料与设备

      1) 限制性内切核酸酶

      2) 模板 DNA 或质粒

      3)TE

      4)TE 饱和酚：氯仿

      5) 氯仿：异丙醇 (24:1)

      6)3mol/LNaAc(pH5.2)

      7) 无水乙醇

      8)5×转录缓冲液：200 mmol/LTris-HCl(PH7.9),300 mmol/LMgCl₂,10 mmol/L 亚精胺，50 mmOl/LNaCl

      9)l00 mmol/LDTT

      10)RNasin

      11)rATP，rGTP,rUTP, 各 2.5 mmol/L

      12)[α⁴²P]rCTP(50uCi,10uCi/ul)(lCi=3.7X1010Bq)

      13)SPG,T3 或 T7RNA 聚合酶

      14)TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇 (25：24:l，pH4.5)

      15)DNase

      16)7.5mol/L 乙酸铵

      17) 无水乙醇

      18)70% 乙醇

      19)DE81 膜

      20)0.5moJ/LNa₂ HPO₄₍pH7,0)

      21) 液闪仪

      22) 琼脂糖

      23) 电泳槽

      24) 离心机


二操作方法

1. 制备 DNA 模板

      1) 确定克隆位点内或其下游的限制性酶切位点，产生预期的失控转录物（run-offtranscript)。尽可能选择产生 5＇突出或黏性末端的限制酶。如果用的酶产生了 3＇突出端，可以换用其他酶，或补平。

      2) 通过琼脂糖凝胶电泳检查消化的完成情况。此时将 DNA 样品置于冰上，如果消化完全则继续下一步，否则，再加限制性内切核酸酶至 DNA 中，反应 30 min，再进行电泳分析。要注意酶不能超过总体积的 10%，因为酶保存在甘油中，过量的话会影响酶活力。

      3) 加入等体积 TE 饱和酚；氯仿，混旋 1 min 抽提 DNA，12000 g 离心 2 min, 转移上层液相至一新管中，加 1 倍体积的氯仿：异丙醇（24:1）混旋 lmin,12000 g 离心 2 min。

      4) 转移上层液相至一新管中，加 0.1 倍体积的 3mol/LNaAc(PH5.2)，2 倍体积的无水乙醉沉淀 DNA，、-70℃ 放置 30 min，12000 g 离心 2 min

       5) 小心倒掉上清，用 1 ml70% 乙醇冼沉淀，12000 g 离心 2 min, 吸弃上清，真空干燥沉淀，然后用无菌水或 TE 缓冲液重悬 DNA 样品至浓度约为 lmg/ml。

2. 体外转录反应

      体外转录体系一般需要加入同位素标记以增强检测的灵敏度。RNA 转录可以用³²P-，³³P-³⁵S-或 ¹ H-标记核糖核苷酸，在 4 种核苷酸中，只有 rCTP 和 rUTP 用于同位素标记。表 3.2 给出了常用的标记核苷酸的特异性。

下面以使用「α³²P」rCTP 为例，说明体外转录体系的操作程序如下.

      1) 按顺序依次加入：

      5X 转录缓冲液                                                4ul

      DTT,100 mmol/L                                              2ul

      RNasin                                                       20-40U

      rATP,rGTP,rUTP(各 2.5 mmnol/L)                       4ul

      线性模板 DNA(0.2〜1 mg/ml)                            1ul

      (a-32P)rCTP(50uCi,10uCi/ul)                              5ul

      SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶                              15〜20U

      加无 RNase 的水至终体积为                             20ul


上述组分需在室温下混合，若在操作，缓冲液中的亚精胺会使 DNA 发生沉淀。

      2) 于 37〜40℃ 反应 lh,

      3) 取出 1ul 测定同位素掺入效率，剩余的样品可用无 RNase 的 DNase 消化。

3. 转录 RNA 产物纯化

      体外转录反应完后，应用 DNA 酶 I 可以把 DNA 模板切除去，这样可以获得高敏感性的 RNA 探针。具有生物活性的 RNA 样品也要求去除 DNA 模板，这时保持 RNA 的完整性是关键的，故 DNase 为不含 RNA 酶的 DNA 酶，它可以有效地去除 DNA 而维持新合成的 RNA 的完整性。

      1) 在体外转录体系内加入 DNA 酶，终浓度为 1U/ug 模板 DNA。

      2) 于 37℃ 孵育 15 min

      3) 用 TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇（25:24:l,pH4.5) 抽提蛋白. 涡旋振荡 lmin,12000 g 离心

      4) 将上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），涡旋振荡 lmin,12000 g 离心

      5) 将上层水相转移到新的离心管中，可以取少量进行变性胶电泳分析，剩佘的进一步沉淀回收

4. 沉淀回收转录 RNA 产物

      1) 加入 0.5 倍体积的 7,5mol/L 乙酸铵。

      2) 加 2.5 倍体积的无水乙醇，混合后置于一 70℃30mim。

      3)12000 g 离心 5 min，小心去除清。

      4) 沉淀用 1 ml70% 的乙醇洗涤，干燥，然后溶于 10〜20ul 的 TE 缓冲液或水中，存于一 70℃。

5. 确定 RNA 转录产物中同位素的掺入比例和 RNA 探针的特异活性

      1) 用 19ul 无核酸酶的水稀释标记好的探针，取稀释好的样品 3ul 点至 4 张 DE81 膜上，室温或灯下使膜干燥。

      2) 直接放两张膜到分开的闪烁瓶中，加入闪烁液并计数。计算每张膜的平均 cpm(每分钟计数) 值，按下面公式确定起始反应中每微升的 cpm 值：

起始反应的总 cpm/ul=每张膜的平均 cptnX(20 倍稀释/3ul)

      3) 从剩余的两张膜上洗去未结合的核苷酸，用 50〜100 ml,0.5mol/LNa₂HPO₄₍pH7.0) 洗三次，沥干水分后放至 70% 乙醇中，取出，室温或灯下干燥。

      4) 把膜放入闪烁瓶后，加入闪烁液计数。计算起始反应中每微升结合到 RNA 上的 cpm 值：

      起始反应中结合的 cpm/ul=每张膜的平均 cpmX(20 倍稀释/3ul)

      此公式也适用于估计同位素标记的 RNA 探针的特异活性.

      5) 由步骤 2) 和 4) 计算结合百分数。

       结合百分数=(结合的 cpm/总 cpm)X100%

      按这种方法算出的结合率通常在 70％〜100%, 放射性标记核苷酸结合率低如低于 50%) 表明 RNA 合成效率较低。

      6) 以 cpm/ugRNA 合成的量计算探针的特异活性。这时要首先计算总的结合 Cpm

      总结合 cpm=(结合的 cpm/ul)X20ul 反应体积

下一步需要计箅反应中核苷酸的总纳摩尔数，用来确定有多少毫克 RNA 合成；
      50uCi [α³²)CTP (400uCi/nmol) 相当于 0.121 nmol ³²P-CTP/反应。加 12umol/L 未标记 CTP(0.24nmOl) 至 CTP 达到 0.36nmol, 如果获得最大的 100% 结合，那么 RNA 转录产物或标记 RNA 探針中 CTP 就代表了 1/4 的核苷酸，探针中核苷酸结合总量应为（0.36nmolX4) 或 1.44nmol, 估计核苷酸的平均分子质量为 330Da，那么样品中 RNA 合成的量为 1.44nmolX(330ng/nmol)—475ng。如果从步骤 5) 算出的结合率为 80%，那么实际反应中合成的量为 475ngX0.80=380ng。

                 SA=总结合 cpm/ugRNA

在这个例子中，SA 就等于总结合 cpm 除以 0.380ug

6. 阳性对照设立与电泳分析

      需要设立阳性对照以检测所用试剂. 和操作步骤是否规范。一般商品化的体外转录试剂盒都带有阳性对照质粒模板。反应体系和样品绀类似，只需将模板更换并不需加入同位素标记的核苷酸。Promega 公司的 RiboProbe 体外转录体系提供的阳性对照质粒含有 T7、T3 和 SP6 等 3 个启动子，使用不同的 RNA 聚合酶，可以转录得到不同大小的转录产物。

      RNA 电泳时，使用含冇 0.5ug/ml 溴化乙锭的 TAE 缓冲液制备琼脂糖凝胶或聚丙_烯酰胺凝胶均可。变性胶（含甲醛，乙二醛或 8mol/L 的尿素）可以用于分离变性的 RNA，而用非变性胶分离在甲醛/甲酰胺 RNA 样品缓冲液中变性的 RNA 也町以得到不错的结果。

注意事项

       1) 使用标准体系时，RNA 回收率低。可能的原因包括：①转录体系中的 DNA 模板量不足由于 DMA 模板可以被转录缓冲液中的亚精胺沉淀，所以要注意在混合各组分时要在室温操作并注意加样顺序.②NaCl 浓度过高 (大于 30 mmol/L)。盐离子浓度过高会严重降低 RNA 聚合酶的活性 (只有 50%), 所以应用柱层析除盐，再用 70% 的乙醇洗涤 1〜2 次。③RNA 酶污染. 在所有的体外转录体系中都必须加入 RNA 酶抑制剂 (如 RNasin), 所有溶液应尽可能使用试剂盒中配制的，自己配制的溶液一定要用 0.2%DEPC 水作为溶剂。④RNA 聚合酶失活。RNA 聚合酶的活性可以 jffi 过合成一组阳性对照来判定。

      2)RNA 转录物不完整, 原因包括:①RNA 合成提前终止。在体系中加入冷的 rNTP(与同位素标记的 rNTP 同种类但没有同位素标记）吋以增加全长转录物的合成效率。此外，可以把反应温度由 37℃ 降低为 30℃②存在聚合酶终止子序列把插入片段重新亚克隆到另一个含不同启动子的载体，有些序列可以被某一种 RNA 聚合酶识别为终止子序列，但不会同时被另一种 RNA 聚合酶识别。③RNA 样品缓冲液降解。如果 RNA 样品缓冲液时间太长或反复冻融，RNA 就可能得到与其真实大小不相符的迁移距离。

       3）得到的 RNA 比预期的长的可能原因是：从 DNA 的错误链起始转录。如果 DNA 模板线性化时使用的内切酶产生了 3＇黏末端，得到的 RNA 就可能比预期的长，如果不能避开使用这类限制性内切核酸酶，那么 DNA 应该用 Klenow 大片段处理便之平端化。

此文转载：丁香通